(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524862.9 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 深圳市优圣康生物科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市大鹏新区葵涌 街道奔康工业园A12栋2 楼东 (72)发明人 喻德华　颜培东　王俊利　陈发钦　 王太重　 (74)专利代理 机构 深圳市育科知识产权代理有 限公司 4 4509 专利代理师 何凯威 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛 查试剂盒及其方法 (57)摘要 本申请实施例涉及生物检测技术领域， 具体 为CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查 试剂盒， 包括用于靶向捕获地中海贫血相关基因 的sgRNA， 用于环化扩增的Y型接头， 用于环化扩 增的引物； 所述sgRNA靶向捕获范围为： chr11: 5166361‑5296578(hg38)， chr16:48994 ‑210817 (hg38)。 该CRISPR、 CAS9 靶向捕获长片段DNA的贫 血筛查试剂盒及其方法， 通过CRISPR、 CAS9系统 靶向捕获地中海贫血变异的大片段区域， 覆盖 α、 β、 δ、 δβ和εγδβ共5种类型地中海贫 血突变区域， 利用三代或者四代长读长测序技 术， 能够有效的检测出人群中可能引起地中海贫 血的致病突变以及复杂结构变异以及大片段缺 失， 覆盖β珠蛋白基因以及相关调控基因包括 HS‑40以及βLCR基因的非缺失以及缺失突变 。 权利要求书2页 说明书8页 附图40页 CN 114752668 A 2022.07.15 CN 114752668 A 1.CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒， 其特征在于： 包括用于靶向捕 获地中海贫血相关基因的sgRNA， 用于环化扩增的Y型接 头， 用于环化扩增的引物； 所述sgRNA靶向捕获范围为： chr11:5166361 ‑5296578(hg38)， chr16:48994 ‑210817 (hg38)， 所述sgRNA捕获区域为， 所述sgRNA序列 为： UAAUACGACUCACUAUAGGGNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNGUUUUAGA GCUAGAAAUAGCAA GUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGA G UCGGUGCU。 2.根据权利要求1所述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒， 其特征 在于： 所述Y 型接头序列为： Y 型通用接头序列： A CAATTTGCA CGAT‑ATGCTTAGA CACCTCCGATTA CG [index]TTCG‑TACGAATCTGTGG。 3.根据权利要求1所述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒， 其特征 在于： 所述引物序列为： F:ACAATTTGCACGATATGCTTAGACACCTR:CCACAGATTCGTA[index] CGTAATCGG。 4.根据权利要求1所述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒， 其特征 在于： 所述sgRNA靶向切割位点可以靶向捕获但限于OR52Z1、 OR51V1、 HBB、 HBD、 HBBP1、 BGLT3 (HS‑40)、 HBG1、 HBG2、 HBE1、 OR51AB1P、 POLR3K、 SNRNP25、 RHBDF1、 MPG、 NPRL3、 HBZ、 LOC107983982、 HBZP1、 HBM、 HBAP1、 HBA2、 HBA 1、 HBQ1、 LUC7L地中海贫血突变相关区域， 包含 chr11:5167971 ‑5295261(hg38)以及c hr16:489 94‑210817(hg38)区域内的任意类型突变。 5.根据权利要求1 ‑4任意所述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒， 其特征在于， 包括以下筛查方法： 制备受试者样本； CRISPR、 CAS9靶向捕获系统捕获chr11: 5166361‑5296578(hg38)， chr16:48994 ‑210817(hg38)片段； 构 建长片段测序文库； 测序并 分析地中海贫血基因突变 类型。 6.根据权利 要求3所述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒的筛查方 法， 其特征在于， 所述筛查 步骤具体为： sgDNA的序列设计： 选择地中海贫血相关区域， 利用C HOPCHOP工具设计sgRNA； 利用NEB快速去磷酸化试剂盒对DNA去磷酸化， 37℃孵育10分钟后， 80℃孵育2分钟， 终 止反应； CRISPR、 CAS9 ‑sgRNA复合物的组装， 彻底混合并在微量离心机中离心， 在37℃下孵育15 分钟， 向每 个样品中加入1 μl蛋白酶K在室温下孵 育10分钟； 加入10ul的DNA， 1μL  10mM dATP和2uL  of Taq DNA聚合酶， 37℃孵育15分钟， Cas9酶 切， 之后72℃孵 育5分钟， 再在DNA末端加上一个A； 接头连接， 接 头连接体系如下表， 2 2℃孵育10分钟； 加入1ul核酸外切酶 Ⅲ， 37℃孵育30分钟， 之后70℃孵 育30分钟灭活； 加入30ulDNA富集磁珠， 室温孵育10分钟， 后置于磁力架之上静置5分钟， 弃掉上清， 用 加入100ul  80％乙醇， 30s之后吸出， 重复一次， 之后开盖， 空气中风干2分钟， 加入24.5ul无 核酸酶水， 孵 育2分钟之后静置 于磁力架上， 待液体澄清后， 洗出 上清至新的PCR管中； 接头环化； 60℃孵育1小时， 之后80℃孵育10分钟灭活环化酶， 后加入4.7ul10X  NEB限 制性内切酶 缓冲液以及核酸外切酶I与I II各1ul， 后37℃孵 育30分钟； 滚环扩增， 将反应 体系30℃孵育6小时， 之后6 0℃孵育10分钟， 后电泳查看扩增情况； 扩增产物用nan opore进行测序。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752668 A 27.根据权利要求4述的CRISPR、 CAS9靶向捕获长片段DNA的贫血筛查试剂盒的筛查方 法， 其特征在于， 所述扩增产物用nanopore进行测序具体为： 将每个DNA样品稀释为1ng/ul， 之后室温孵 育10分钟， 6 5摄氏度孵 育5分钟， 冰上孵 育1分钟； 将以上反应产物直接加入下方体系中， 之后室温孵育10分钟， 65摄氏度孵育5分钟， 冰 上孵育1分钟； 配制AMII接头蛋白连接体系， 室温孵育15min， 之后按照照1:1的比例向样品管中加入 AMPure XP磁珠， 将试管转移到磁力架上， 静置2min， 弃上清， 加入200 μlSFB重悬并离心， 之 后加入加入15 μlEB溶液室温孵育2min， 之后放置于磁力架上， 静置2min， 待磁珠被吸引至靠 近磁力架的一侧或溶液变澄清， 小心吸取上清， 最终得到文库， 使用MinION、 Gri dION Mk1、 PromethION  P24测序仪上机测序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752668 A 3