(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210532617.2 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301号 (72)发明人 吕鹏 张茹松 潘晔 刘晓勇  姚勤 陈克平  (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 家蚕核型多角体病毒抗性相关的SNP分子标 记及其应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学及分子育种技术领 域, 具体涉及家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性 相关的SNP分子标记及其应用。 所述SNP分子标记 包括Chr3‑746标记和Chr27 ‑5071标记的组合; 所 述Chr3‑746标记位于家 蚕p50T基因组的3号染色 体序列的第149 51064位, 碱基多态性为G/A; 所述 Chr27‑5071标记位于家蚕p50T基因组的27号染 色体序列的第9462596位, 碱基多态性为C/G。 本 发明所述SNP分子标记能够有效区分BmNPV抗感 家蚕, 降低检测的假阳性率, 提高准确率, 并且能 够快速、 高通量的筛选, 解决家蚕传统育种的技 术问题, 加快家蚕BmNPV抗 性品种的选 育。 权利要求书1页 说明书16页 序列表2页 附图7页 CN 114854876 A 2022.08.05 CN 114854876 A 1.家蚕核型多角体病毒抗性相关SNP分子标记, 其特征在于: 所述SNP分子标记包括 Chr3‑746标记和Chr27 ‑5071标记; 所述Chr3 ‑746标记位于家蚕p50T基因组 的3号染色体序 列的第14951064位, 碱基多态性为G/A; 所述Chr27 ‑5071标记位于家 蚕p50T基因组的27号染 色体序列的第9462596位, 碱基多态性 为C/G。 2.检测权利要求1所述SNP 分子标记的引物, 所述引物包括分别用于扩增Chr3 ‑746标记 和Chr27‑5071标记的引物组; 所述用于扩增Chr3 ‑746标记的引物组包括SEQ.ID.NO.1 ‑3所 示引物序列, 用于扩增C hr27‑5071标记的引物组包括SEQ.ID.NO.4 ‑6所示引物序列。 3.根据权利要求2所述的引物, 其特征在于, 所述用于扩增Chr3 ‑746标记的引物组中 SEQ.ID.NO.1所示引物用于匹配A等位基因, SEQ.ID.NO.2所示引物用于匹配G等位基因; 所 述用于扩增Chr27 ‑5071标记的引物组中SEQ.ID.NO.4所示引物用于匹配G等位基因, SEQ.ID.NO.5所示引物用于匹配C等 位基因。 4.根据权利要求2或3所述的引物, 其特征在于, 所述用于扩增Chr3 ‑746标记的引物组 中SEQ.ID.NO.1所示引物和用于扩增Chr27 ‑5071标记的引物组中SEQ.ID.NO.4所示引物采 用HEX或VIC荧光探针分别标记; 用于扩增Chr3 ‑746标记的引物组中SEQ.ID.NO.2所示引物 和用于扩增C hr27‑5071标记的引物组中SEQ.ID.NO.5所示引物采用FAM荧 光探针分别标记。 5.检测或辅助检测家蚕BmNPV抗性的产品, 所述产品包括权利要求1所述分子标记或权 利要求2‑4任一项所述的引物; 所述产品包括检测试剂、 试剂盒 或芯片。 6.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2 ‑4任一项所述的引物或权利要求5所述 的产品在以下任一方面的应用: (1)用于家蚕种质资源或者品种的鉴定; (2)用于家蚕BmNPV病抗 性品种纯度的鉴定; (3)用于家蚕的BmNPV病抗 性性状的鉴定; (4)用于家蚕的分子标记辅助育种; (5)用于家蚕的BmNPV病抗 性基因的定位与鉴定; (6)用于制备检测家蚕BmNPV病抗 性或性状鉴定的产品。 7.根据权利要求6所述的应用, 其特征在于, 包括如下步骤: 提取待测家蚕样品的基因 组DNA; 对提取的基因组DNA进行Chr3 ‑746标记和Chr27 ‑5071标记的基因多态 性或基因型的 检测; 根据检测结果进行判断、 鉴定或辅助育种。 8.根据权利要求7所述的应用, 其特征在于, 所述检测结果的判断、 鉴定或辅助育种方 法为: 若Chr3 ‑746标记的基因型为GG或Chr27 ‑5071标记的基因型为CC, 则待检家 蚕为BmNPV 病感病家蚕; 若Chr3 ‑746标记的基因型为AA或AG且Chr27 ‑5071标记的基因型为GG或GC, 则 待检家蚕为BmNPV病抗病家蚕。 9.根据权利要求7所述的应用, 其特征在于, 采用KASP技术检测基因多态性或基因型, 所述KASP技术的PCR扩增体系以5 μL计为: 2.5 μL  KASP Master Mix(2x), 0.7 μL  KASP引物组 (10 μM浓度的F 1、 F2引物各0.15 μL, 10 μM浓度的R引物0.4 μL), 1 μL基因组DNA(2 0~50ng/ μL), 加ddH2O补充体系至 5 μL。 10.根据权利要求9所述的应用, 其特征在于, 所述KASP技术的PCR扩增程序为: 94℃预 变性10min; 94℃变性20s, 65℃退火1min, 每个循环退火温度降0.8℃, 共10个循环; 94℃变 性20s, 57℃退火1mi n, 共27~3 0个循环; 25℃延伸3 0s, 收集荧光信号。权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 114854876 A 2家蚕核型多角体病毒抗性相关的SNP分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及分子育种技术领域, 具体涉及家蚕核型多角体病毒抗性 相关的SNP分子标记及其应用。 背景技术 [0002]家蚕是生产蚕茧的重要经济昆虫, 家蚕核型多角体病毒(Nuclear  polyhedrosis   virus, BmNPV)引起的血液脓病是世界养蚕业一种重大的传染性疾病, 该病引起的蚕茧损失 大约占蚕病引起总损失的60%以上。 现有的研究证明家蚕对BmNPV病的抗性存在主效控制 基因; 家蚕BmNPV的抵抗性及其遗传规律的试验研究表明家蚕品系间存在抗性差异, 抗性对 感性呈不完全显性, 抗性是由两对以上基因控制的。 对家蚕BmNPV病的防治, 选育抗BmNPV新 品种是最直接有效的途径, 一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性家蚕品种的研 究, 其抗性基因的鉴定对抗病品种的选 育与推广具有重要的作用。 [0003]分子标记辅助选择技术(Marker  assisted  selection,MAS)是一种利用性状相关 的标记(如DNA变异)来间接 选择目的基因或目的性状的技 术, 包括RAP D, RFLP, S SR和SNP等。 [0004]单核苷酸多态性(Single ‑nucleoti de polymorphism,SNP)是指基因组水平上的 单个核苷 酸的变异引起的一种DNA序列多态 性, 包括碱基的转换和颠换。 随着高通量测序技 术的发展, SNP位点在基因组中被广泛的发现。 作为第三代分子标记技术, SNP具有数量多, 在基因组上分布均一; 遗传稳定性高, 突变频率低; 易于检测, 适于快速、 规模化筛查等特点 而被广泛应用于遗传图谱构建、 基因定位、 辅助育种等。 竞争性等位基因特异性PCR (Kompetitive  Allele Specific  PCR,KASP)是SNP标记检测常用的一种高通量基因分型技 术, 基于引物末端碱基的特异 性匹配对SNP分型, 即通过2条位点特异 性上游引物, 一条通用 下游引物和2个通用荧光探针对目标SNP标记进行检测。 KASP技术用于SNP标记检测具有高 度的稳定性和准确 性, 且能实现高通量筛选, 是分子辅助育种及目的性状鉴定的主要技术 手段。 [0005]目前研究发现的家蚕BmNPV病抗性相关基因连锁的分子标记多为RAPD标记或SSR 标记, 但是这两种分子标记对于抗性基因的鉴定操作复杂, 检测效率低, 且与抗性性状呈现 不完全连锁, 不 适用于分子标记辅助家蚕育种。 [0006]基于遗传规律的研究表明家蚕BmNPV病抗性性状是由2对或2对以上基因控制的, 且存在叠加效应; 现有的研究结果也表明基于单个抗性基因连锁的分子标记不能有效鉴定 家蚕BmNPV病抗性性状。 现 阶段, 家蚕BmNPV病 抗性品种的选育主要依靠传 统的表型鉴定方 法, 工作量大, 周期长且准确性易受环境影响。 因此, 开发适用于高通量检测平台且能够快 速、 准确鉴定家蚕BmNPV病 抗性性状的SNP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、 提 高家蚕育种的效率和技 术水平具有重要意 义。 发明内容 [0007]为了解决上述背景中的技术问题, 本发明提供了家蚕BmNPV抗性SNP分子标记组,说 明 书 1/16 页 3 CN 114854876 A 3

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