(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524072.0 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 中国科学院华南植物园 地址 510650 广东省广州市天河区兴科路 723号 (72)发明人 侯兴亮　胡一龙　余斌　孔凡江　 汤杨　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 朱聪聪　刘明星 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 1/21(2006.01)C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/10(2018.01) A01H 6/54(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用 (57)摘要 本发明公开了 大豆GmCOL2b基因在调控种子 大小中的应用， 属于植物分子生物学领域。 本发 明提供了提供GmCOL2b蛋白或其编码基因等的相 关生物材料在调控大豆种子大小中的应用， 所述 GmCOL2b蛋白为氨基酸序列为SEQ  ID No.3的蛋 白质， 具体地， 是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所 述大豆中的表达量和/或活性， 使大豆的种子变 小。 本发明还提供了一种培育种子更小的大豆的 方法， 是通过对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码 基因进行敲除而得到， 所述编码基因的核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示。 本发明为作物育种提供 了宝贵的基因资源， 可将大豆GmCOL2b基因广泛 应用于大豆 育种中。 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图4页 CN 114805517 A 2022.07.29 CN 114805517 A 1.大豆GmCOL2b蛋白或其相关生物材料在大豆育种中的应用， 其特征在于， 所述的大豆 GmCOL2b蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID No.3所示。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的在大豆育种中的应用是调控大豆种 子大小中的应用。 3.根据权利 要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述的相关生物材料为大豆GmCOL2b蛋 白的编码基因， 或含有所述核酸分子的表达盒、 重组载体或重组细胞。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所示。 5.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的调控大豆种子大小， 是通过降低所 述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性， 使大豆的种子变小； 或通过提高所述 GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性， 使大豆的种子变大。 6.一种培育种子更小的大豆的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 对受体大豆中 GmCOL2b蛋白的编码基因进 行敲除， 得到种子更小的转基因大豆； 所述编码 基因的核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示。 7.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述的敲除是用CRISPR/Cas  9系统对受体 大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的CRISPR/Cas  9系统中， gRNA序列为： AAATGCTGCG GCACCTGAAC。 9.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： a.将靶点连接到U3  gRNA表达盒， 构建CRISPR/gRNA载体； 然后将CRISPR/gRNA载体连接 到pPTG‑gRNA‑Cas9‑AtU6‑1双元载体， 获得GmCOL2b敲除载体； 所述的靶点序列为： GTTCAGGTGCCGCAGCAT TTTCAACCCGG； b.利用农杆菌介导的遗传转化将所述GmCOL2b敲除载体导入大豆愈伤组织中， 获得从 愈伤组织 转化而来的植株co l2b； c.通过PCR对基因敲除靶点 位置进行扩增并测序； d.从T1代开始筛 选除草剂阴性且 靶点纯合 植株， 从而得到种子更小的转基因大豆 。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 使用的引物序列如下： 步骤a中， 所述G mCOL2b敲除载体的构建引物： COL2b‑AtU6‑29T4F:attgAAATGCTGCG GCACCTGAAC， COL2b‑AtU6‑29T4R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCAT TT； 步骤c中， 所述 通过PCR对基因敲除靶点 位置进行扩增并测序的检测引物： COL2b‑target‑F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT， COL2b‑target‑R:TGACTA AGAGAACCATCGTAACTG； 步骤d中， 所述筛 选除草剂阴性且 靶点纯合 植株的检测引物： COL2b‑target‑F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT， COL2b‑target‑R:TGACTA AGAGAACCATCGTAACTG。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114805517 A 2大豆GmCOL2b基因在调控种子大小 中的应用 技术领域 [0001]本发明属于植物分子生物学领域， 具体涉及大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中 的应用。 背景技术 [0002]大豆(Glycine  max)是我国重要的经济和粮食作物， 近年来， 国内不断增长的大豆 需求量导致国内大豆产量远远不能满足我国自身的大豆需求， 对外依存度极高。 大豆精准 遗传改良可以大幅度加快大豆品种选育进程， 对满足大豆生产需求意义重大。 大豆种子大 小是一个重要而复杂的农艺性状， 与大豆产量和品质之间同时存在 复杂且密切的联系， 小 粒品种往往具有更高的单株产量和品质， 而大豆种子大小受多基因控制， 可以通过遗传改 良来控制。 [0003]近年来， 大豆种子大小的研究一直都在进行。 目前已有许多与大豆种子大小调控 相关基因被克隆并通过转基因实验验证。 例如， GmMYB73和GmGA20OX通过转化拟南芥得以验 证； 还有很多基因已在大豆本身得到验证， 包括GmSWEET10 a、 GmSWEET10b和GmSWEET39等糖 转运相关基因， GmCYP78A72和GmCYP78A5等细胞色素相关基因， 以及GmFAD3、 BIG  SEEDS1、 GmWRKY15a、 PP2C ‑1、 GmLEC2等。 但 目前为止， 调控大豆种子大小 的分子机理仍未被完全阐 明， 各基因之 间的调控网络尚不明 晰。 因此， 进一步挖掘与大豆种子大小相关基因对人们深 入了解种子发育过程以及提高产量具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用， 以解决上 述现有技术存在的问题， 该基因是大豆种子大小的关键调控基因， 可以用于大豆不同种子 大小品种的培 育。 [0005]本发明的第一个目的是提供GmCOL2b蛋白或其相关生物材料在大豆育种中的应 用， 特别是调控大豆种子大小 中的应用； 所述GmCOL2b蛋 白为氨基酸序列为SEQ  ID No.3的 蛋白质。 所述的调控大豆种子大小可以应用于 培育新品种大豆或者 鉴定与筛 选大豆品种。 [0006]优选地， 所述的相关生物材料为大豆GmCOL2b蛋白的编码基因， 或含有所述核酸分 子的表达盒、 重组载体或重组细胞。 [0007]更优选地， 所述编码基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示。 [0008]进一步地， 所述的调控大豆种子大小， 是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中 的表达量和/或活性， 使大豆的种子变小； 或通过提高所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表 达量和/或活性， 使大豆的种子变大。 [0009]本发明第二个目的是一种培育种子更小的大豆 的方法， 包括以下步骤： 对受体大 豆中GmCOL2b蛋白的编码 基因进行敲除， 得到种子更小的转基因大豆； 所述编码 基因的核苷 酸序列如SEQ  ID No.2所示。 [0010]优选地， 所述的敲除是用CRISPR/Cas  9系统对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基说　明　书 1/4 页 3 CN 114805517 A 3