(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524929.9 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 张臣臣　虞星彤　顾瑞霞　陈大卫　 关成冉　黄玉军　 (74)专利代理 机构 扬州苏中专利事务所(普通 合伙) 32222 专利代理师 沈志海 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301的菌株水平 计数 引物及其活菌 计数方法 (57)摘要 本发明涉及一种鼠李 糖乳杆菌hsryfm  1301 的菌株水平计数引物及其活菌计数方法， 引物 为： Y3F:TTCAAGCAGTCCAATCCGCA;Y3R: ACCAAGTTCGGAGGCAATGAT。 通过菌株特异性的计 数专用引物， 将计数水平提高至菌株级； 通过优 化DNA提取流程， 提高DNA提取效率； 通过添加 PMA， 去除死菌干扰， 最终实现针对鼠李 糖乳杆菌 hsryfm 1301的菌株水平的活菌计数。 本发明实 现特异性菌株 （针对 Lactobacillus  rhamnosus   hsryfm 1301） 的菌株 水平计数， 能够在混菌体系 中对目的菌株进行计数， 具有市场实施的可能性 和较好的预期经济效益。 权利要求书2页 说明书4页 序列表1页 附图10页 CN 114891863 A 2022.08.12 CN 114891863 A 1.鼠李糖乳杆菌 hsryfm 1301的菌株水平计数引物， 其特 征是， 所述引物如下： 引物名称 引物的序 列 序列编号 Y3F TTCAAGCAGTCCAATCCGCA SEQ ID NO.1 Y3R ACCAAGTTCGGAGGCAATGAT SEQ ID NO.2 。 2.利用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌hsryfm  1301的菌株水平计数引物进行活菌计 数方法， 其特 征是， 包括以下步骤： (1)、 取500 μL鼠李糖乳杆菌hsryfm  1301菌悬液置于1.5mL离心管 中， 加入PMA使其终质 量浓度为50 μmol/L， 充分混匀后， 将其置于黑 暗中孵育15min， 保证PMA可以进入死菌中； 然 后将离心管打开放在冰 上， 在500W卤素光源 下20cm处曝光15min， 使PMA与细菌DNA尽可能地 结合完全； 随后10000r/min离心10min， 取沉淀收集菌体， 180 μL  20mg/mL的溶菌酶处理2h， 20 μL 20mg/mL蛋白酶K处 理30min， 采用细菌基因 组DNA快速提取 试剂盒提取DNA； (2)、 将DNA样品进行10倍梯度稀释作为模板， 稀释次数为n； 2*AceQ  Universal  SYBR  qPCR Master Mix进行扩增， 扩增的qPCR反应体系见表1， qPCR扩增程序见表2， 扩增区在鼠 李糖乳杆菌hsryfm  1301中的拷贝数为2； 记录Ct值， 利用下面活菌数计算公式计算鼠李糖 乳杆菌hsryfm 1301的活菌数： 表1 qPCR反应 体系 表2 qPCR扩增程序权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891863 A 23.根据权利要求2所述的方法， 其特征是， 步骤(1)中， 细菌基因组DNA快速提取试剂盒 为生工生物工程(上海)股份有限公司生产的试剂盒。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征是， 步骤(2)中， 2*AceQ  Universal  SYBR qPCR  Master Mix由南京诺维赞生物科技有限公司提供。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特 征是， 步骤(2)中， 扩增长度限制在3 00bp之内。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891863 A 3