(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524481.0 (22)申请日 2022.05.13 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO.M 2019743 2019.09.23 (71)申请人 中国农业科 学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡 徐家坪1号 (72)发明人 尚佑军　吴锦艳　田宏　马维民　 何继军　颜新敏　吕律　杜国玉　 李玲霞　孙健飞　张成　 (74)专利代理 机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 1 1139 专利代理师 马鑫 (51)Int.Cl. G01N 33/569(2006.01)G01N 33/543(2006.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于单域抗体9-4-2免疫磁珠直扩检测山羊 痘病毒的试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于单域抗体9 ‑4‑2免疫 磁珠的直扩检测山羊痘病毒的试剂盒及其应用。 所述试剂盒包括SEQIDN O.1所示的山羊痘病毒单 域抗体9‑4‑2通过链霉亲和素 ‑生物素与磁珠进 行偶联得到的单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠。 本发明 使用切胶纯化的单域抗体9 ‑4‑2蛋白与磁珠进行 偶联获得免疫磁珠， 免疫磁珠富集山羊痘病毒 后， 无需提取基因组RNA， 可直接对其进行扩增。 本发明的提出克服了山羊痘病毒由于形成夹皮 时间久， 不容易在病毒复制高峰期发现， 采集病 料病毒含量低微， 所 以检出率低， 容易漏检等现 象； 以及提取基因组DNA时费时、 费财、 费力， 操作 时污染环境等一系列难题， 而且高效、 灵敏、 特 异、 稳定、 实用， 本发明的提出为山羊痘病毒病的 检测提供了一种高效的技 术手段。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114924069 A 2022.08.19 CN 114924069 A 1.一种基于单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠的直扩检测山羊痘病毒的试剂盒， 其特征在于， 所 述试剂盒包括山羊痘病毒单域抗体9 ‑4‑2通过链霉亲和素 ‑生物素(SA ‑Biotin)与磁珠进行 偶联得到的单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠， 所述的山羊痘病毒单域抗体9 ‑4‑2的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的山羊痘病毒单域抗体9 ‑4‑2由保藏 编号为CCTCC  NO.M 2019743， 保藏名称为大肠杆菌9 ‑4‑2/GTPV的菌株产生， 并通过切胶纯 化的方法获得。 3.如权利要求1所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂 盒还包括用于直扩检测山羊痘 病毒的上游引物、 下游引物和探针， 所述上游引物、 下游引物和探针的序列分别为： 上游引物： 5 ’ ‑TATTTTGTGCGGAAACGTGTTTGTA‑3’； 下游引物： 5 ’ ‑ATTATAGGAATTGTTGAGAGAGAT ‑3’； 探针： 5’ ‑TTTTATCAGATGAT TGCGTAATCTTAAC‑3’。 4.如权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述的试剂盒还 包括直扩反应液。 5.如权利要求1所述的试剂 盒， 其特征在于， 使用所述的试剂 盒用于检测山羊痘病 毒抗 原时， 按照以下步骤进行： 1)病毒的富集： 取单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠10μL于1.5mL 的EP管中， 加入离心后待检样 本上清10 0 μL， 震荡混匀， 置 于4℃冰箱， 富 集12h或过夜； 2)磁珠的洗涤： 待病毒富集完成后， 将EP管放置于磁力架上， 弃去上清， 用1mlpH值7.6， 0.05M的PBS缓冲液洗涤3次， 最后用5 0 μL PBS缓冲液重悬， 得到混悬 液为富集病毒的产物； 3)建立50 μL直扩反应体系： 直扩反应液40 μL， 上、 下游引物和探针混合液5 μL， 混悬液5 μ L； 扩增程序为： 9 5℃10min； 95℃10s， 60℃30s， 5个循环预扩增； 9 5℃10s， 54℃30s， 共进行40 个循环并采集 荧光； 所述引物、 探针的序列分别为： 上游引物： 5 ’ ‑TATTTTGTGCGGAAACGTGTTTGTA‑3’； 下游引物： 5 ’ ‑ATTATAGGAATTGTTGAGAGAGAT ‑3’； 探针： 5’ ‑TTTTATCAGATGAT TGCGTAATCTTAAC‑3’。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的上、 下游引物以及探针的浓度均为 10 μM。 7.权利要求1 ‑6任一项所述的试剂盒在制备检测山羊痘病毒抗原试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114924069 A 2基于单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠直扩检测山羊痘病毒 的试剂盒 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种免疫磁珠试剂盒， 特别涉及一种基于单域抗体免疫磁珠的直扩检 测山羊痘病毒的试剂盒及其用途， 本发明属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]羊痘是以山羊或绵羊痘病毒引起主要以发热和全身性丘疹或结节为特征的一种 急性、 热性、 高度接触性传染病， 发病率、 病 死率高， 是所有动物痘病中最为严重的一种。 病 毒主要存在于病羊的皮肤、 黏膜的丘疹、 脓疱、 痂皮内及鼻黏膜分泌物中， 其典型变化过程 一般先形成红色斑疹， 再由斑疫转变成白色丘疫， 然后形成水疱和结痂。 该病具有一定潜伏 期， 10‑14天病毒含量达到峰值， 经过3 ‑6周之后会降低。 养殖场等发现问题时往往到后期阶 段， 采集的病料病毒含量比较低， 给检测 和分离病毒带来 一定困难。 [0003]单域抗体是抗体分子的最小抗原结合单元， 仅由一个可变结构域或一个仅协助靶 标结合的工程化的恒定结构域组成， 不含普通抗体的Fc段， 因此， 单域抗体能够 避免由Fc段 引起的补体反应。 故越来越多地应用于生物探测、 诊断、 制药等领域。 而免疫磁珠技术 (Immunomagnetic  beads,IMB)是一种以抗原抗体反应为基础， 以磁载体技术为媒介的新型 诊断技术。 经过一定处理将抗体结合在磁珠上， 作为抗体载体的磁珠与抗原物质结合后， 形 成免疫复合物， 在磁铁磁力的作用下， 这种复合物发生力学移动， 将与磁殊上抗体特异 性结 合的抗原与其它物质分离。 此技术已应用于免疫检测、 细胞分离、 蛋白质纯化等方面。 由于 其特有的快速、 高效、 低毒、 特异性高、 操作简单等特点 为抗原检查隐性感染提供了新思路。 [0004]本发明将单域抗体和免疫磁珠技术结合起来， 无需复杂的纯化设备和技术， 对样 品的澄清度也无限制， 只需要简单 的磁性吸 附步骤即可很方便地检测低位含量羊痘病毒。 从而获得了检测速度快、 特异性高、 灵敏度高和重复性 好的免疫检测方法。 发明内容 [0005]针对现有技术中存在的山羊痘病毒抗原检测过程中由于病毒含量低微， 无法达到 PCR或Real ‑time‑PCR检测最低要求而出现假阴性结果以及提取RNA费时、 费力， 购买RNA提 取试剂盒耗资等一系列难题， 本发明一方面利用切胶纯化方法制备了高纯度单域抗体蛋 白， 较普通方法制备蛋白纯度更好， 更利于标记， 标记后的免疫磁珠富集山 羊痘病原的特异 性更强； 另一方面免去基因组DNA 提取这一关键环节， 直接扩增富集产 物进行实时荧光定量 检测， 节省时间， 节省人力、 物力、 财力， 提高经济效益。 [0006]具体的， 为了 达到上述目的， 本发明采用了以下技 术手段： [0007]本发明的一种基于单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠直扩检测山羊痘病毒的试剂盒， 所述 试剂盒包括山羊痘病毒单域抗体9 ‑4‑2通过链霉亲和素 ‑生物素(SA ‑Biotin)与磁珠进行抗 体偶联得到的单域抗体9 ‑4‑2免疫磁珠， 所述的山 羊痘病毒单域抗体9 ‑4‑2的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。说　明　书 1/5 页 3 CN 114924069 A 3