(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210518171.8 (22)申请日 2022.05.12 (71)申请人 西安博睿康宁生物医学中心有限公 司 地址 712000 陕西省咸阳市渭城区周陵街 办长信科技产业园17幢 (72)发明人 李睿　高博　刘贵明　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 用于检测人类BRAF基因V600E突变的引物探 针组合、 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明涉及肿瘤靶向用药基因检测突变检 测技术领域， 具体公开了用于检测人类BRAF基因 V600E突变的引物探针组合、 试剂盒和方法。 本发 明用于检测人类BRAF基因V 600E突变的引物 探针 组合， 其包含两条上游引物、 一条下游引物、 一条 荧光探针和两条阻碍探针； 两条所述上游引物如 SEQ ID NO.1‑2所示， 所述下游引物如SEQ  ID  NO.3所示， 所述荧光探针如SEQ  ID NO.4所示， 两 条所述阻碍探针如SEQ  ID NO.5‑6所示。 本发明 利用双引物探针以及阻碍探针来降低正常基因 对检测的干扰， 提高了检测灵敏度， 且检测速度 快速准确。 可进行突变率达 0.1％的DNA检测。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114774550 A 2022.07.22 CN 114774550 A 1.用于检测人类BRAF基因V600E突变的引物探针组合， 其特征在于， 包含两条上游引 物、 一条下游引物、 一条荧光探针和两条阻碍探针； 两条所述上游引物如SEQ  ID NO.1‑2所 示， 所述下游引物如SEQ  ID NO.3所示， 所述荧光探针如SEQ  ID NO.4所示， 两条所述阻碍探 针如SEQ ID NO.5‑6所示。 2.根据权利 要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 如SEQ  ID NO.1所示的上游引物、 所述下游引物、 所述荧光探针和如SEQ  ID NO.5所示的阻碍探针在反应体系1中使用， 所述 反应体系1用于检测突变序列； 如SEQ ID NO.2所示的上游引物、 所述下游引物、 所述荧光探针和如SEQ  ID NO.6所示 的阻碍探针在反应 体系2中使用， 所述反应 体系2用于检测野生序列。 3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合， 所述荧光探针的两端分别标记有荧光报告 基团和荧 光猝灭基团； 和/或， 两条 所述阻碍 探针的3’端用‑NH2修饰。 4.根据权利要求1～3任一项所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述荧光报告基团为 选自FAM， VIC， C Y5中的任一种； 所述 荧光猝灭基团为选自BHQ1， NH2， MGB中的任一种。 5.权利要求1～4任一项所述的引物探针组合在制备用于检测人类BRAF基因V600E突变 的试剂盒中的应用。 6.用于检测人类BRAF基因V600E突变的试剂盒， 其特征在于， 包含权利 要求1～4任一项 所述的引物探针组合。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒在进行荧光定量PCR反应时 的条件为： 94℃2mi n； 95℃30s， 65℃30s， 运行40个 循环， 在6 5℃时收集信号。 8.根据权利要求6或7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒在进行荧光定量PCR反应 时每20 μL无模板反应体系为： 缓冲液 12.5 μL， 10 μM上游引物0.2 μL， 10 μM 下游引物0.2 μL， 10 μ M荧光探针0.1 μL， 10 μM阻碍 探针0.1 μL， 水6.9 μL。 9.一种非疾病诊断目的检测人类BRAF基因V600E突变的方法， 其特征在于， 以待测 样品 的DNA为检测模板， 进行两次荧光定量PCR反应， 第一次荧光定量PCR反应利用如SEQ  ID  NO.1所示的上游引物、 如SEQ  ID NO.3所示的下游引物、 如SEQ  ID NO.4所示的荧光探针和 如SEQ ID NO.5所示的阻碍 探针进行， 获得反应 体系1的FAM信号 值； 第二次荧光定量PCR反应利用如SEQ  ID NO.2所示的上游引物、 如SEQ  ID NO.3所示的 下游引物、 如SEQ  ID NO.4所示的荧光探针和如SEQ  ID NO.6所示的阻碍探针进行， 获得反 应体系2的FAM信号 值； 当反应体系2的FAM信号值高于反应体系1的FAM信号值， 且两个FAM信号Ct差值ΔCt大 于8时， 则判断检测结果 为阴性， Δ Ct小于等于8时， 则判断检测结果 为V600E突变阳性； 当反应体系2的FAM信号值等于反应体系1的FAM信号值， 且两个FAM信号Ct差值ΔCt小 于等于1时， 则判断检测结果 为V600E突变阳性； 当反应体系2的FAM信号值低于反应体系1的FAM信号值， 且两个FAM信号Ct差值ΔCt大 于1时， 则判断检测结果有误， 需重新取样检测。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR反应的条件为： 94℃ 2min； 95℃30s， 65℃30s， 运行40个 循环， 在6 5℃时收集信号； 所述荧光定量PCR反应的每20 μL无模板反应体系为： 缓冲液12.5 μL， 10 μM上游引物0.2 μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774550 A 2L， 10 μM下游引物0.2 μL， 10 μM荧 光探针0.1 μL， 10 μM阻碍 探针0.1 μL， 水6.9 μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774550 A 3