(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210520811.9 (22)申请日 2022.05.12 (71)申请人 温州医科 大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南 路38号温州市国家大 学科技园孵化器 (72)发明人 孙文悦　董雯佳　郑潮钏　郑来宝　 楼永良　 (74)专利代理 机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 专利代理师 朱海晓 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas- SDA-AuNPs的细菌 检测方法 (57)摘要 本发明属于细菌检测技术领域， 具体涉及一 种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas ‑ SDA‑AuNPs的细菌检测方法。 本发明引入CRISPR ‑ Cas系统， 通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和 SDA进行检测信号放大， 提出了基于CRISPR/ Cas12a‑SDA和DNA ‑AuNPs光热效应的细菌检测方 法， 可以实现对细菌的简便、 快速、 高灵敏检测。 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 CN 114807400 A 2022.07.29 CN 114807400 A 1.一种用于检测细菌的试剂盒， 其特征在于： 包括SDA体系、 CRISPR/Cas体系和DNA ‑ AuNPs； 所述SDA体系包括Template、 Primer、 Bst3.0  DNA聚合酶、 Nt.BbvCI切刻内切酶、 dNTPs； 所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA， 所述Cas12a和crRNA可识别细菌基 因组并在 识别出含有目标细菌基因 组后可非特异性切割Template； 所述DNA ‑AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0  DNA聚合酶和 Nt.BbvCI内切酶作用下 经过链置换等温扩增后产生的s sDNA链两端互补。 2.根据权利要求1所述的用于检测细菌的试剂盒， 其特征在于： 所述DNA ‑AuNPs为SH ‑ DNA1和SH ‑DNA2与AuNPs 混合孵育得到； SH‑DNA1序列为5 ’ ‑  TTG TCG TTG CGT GCT GA‑SH‑3’； SH‑DNA2序列为5 ’ ‑  SH‑CCC AGG TTC TCT  ‑3’； Template序列为5 ’ ‑ CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAA GTA  GCG TG‑3’； Primer序列为5 ’ ‑  CAC GCT ACT TTG CTA A‑3’； crRNA序列为5 ’ ‑  UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG CCU AGA UAA AGA AGA AC‑3’。 3.根据权利要求2所述的用于检测细菌的试剂盒， 其特征在于： 所述DNA ‑AuNPs为SH ‑ DNA1和SH ‑DNA2与AuNPs混合后于36 ‑38℃振荡孵育10 ‑50分钟， 然后加入柠檬酸/盐酸缓冲 液， 震荡孵 育振荡孵 育8‑12小时。 4.根据权利要求3所述的用于检测细菌的试剂盒， 其特征在于： 柠檬酸/盐酸缓冲液孵 育时间为10小时。 5.根据权利 要求2所述的用于检测细菌的试剂盒， 其特征在于： 所述DNA和AuNP s的最佳 比例为20 0： 1。 6.一种基于CRISPR/Cas ‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法， 所述方法为非疾病诊断或治疗应 用， 其特征在于： 其采用如权利要求1 ‑5任一项所述的用于检测细菌的试剂盒； 所述方法包括以下步骤： （1） 采用CRIS PR/Cas体系与待测试样进行酶切反应， 得到酶切反应液； （2） 采用S DA体系对步骤 （1） 得到的酶切反应液进行扩增得到S DA扩增产物； （3） 将SDA扩增产物与DNA ‑AuNPs混合进行反应。 7.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas ‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法， 其特征在于： 步 骤 （1） 中酶切反应得到的酶切反应液先通过升温孵育进 行Cas酶活性 灭活， 灭活后进 行杂交 反应使灭活过程中打开的杂交双链重新恢复为杂交双链， 然后在步骤 （2） 中采用SDA体系进 行扩增。 8.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas ‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法， 其特征在于： 步 骤 （2） 中所 得到的SDA扩增产物通过升温孵 育进行酶失活。 9. 根据权利要求6所述 的基于CRISPR/Cas ‑SDA‑AuNPs的细菌检测 方法， 其特征在于： 步骤 （3） 反应后， 通过光热检测， 当存在创伤弧菌时， 经过660  nm激光照射后， 温度上升幅度 小于无创伤弧菌的对照组。 10. 根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas ‑SDA‑AuNPs的细菌检测方法， 其特征在于： 步骤 （3） 反应后， 通过UV ‑vis检测， 所述细菌为创伤弧菌， 所述细菌浓度与步骤 （3） 得到的反权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807400 A 2应液于530 nm处吸光度值呈正比。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807400 A 3