(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210511498.2 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 江苏命码生物科技有限公司 地址 225300 江苏省泰州市药城大道1号G 幢(G13) (72)发明人 张辰宇　王延博　管丹萍　蒯健　 (74)专利代理 机构 北京智丞瀚方知识产权代理 有限公司 1 1810 专利代理师 姜司晨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于早期预警新型冠状病毒中重型、 危 重型病例的试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于早期预警新型冠状 病毒中重型、 危重型病例的试剂盒， 以及试剂盒 中所使用的特异性引物和探针。 与现有技术相对 比， 本发明具有以下优点： 本发明所提供的特异 性引物、 探针和试剂盒， 其针对的miR ‑nsp3‑3p、 miR‑7‑5p、 miR‑24‑3p、 miR‑223‑3p、 内参基因的 引物探针序列特异性好， 无非特异性扩增， 检测 的灵敏性和特异性高； 该标志物中的一个由新冠 病毒编码， 本身就是病毒的核酸物质， 因此具有 疾病特异性； 另 外三个miRNA属于人自身内源性 miRNA， 其变化与机体状态及对新冠病毒的反应 密切相关， 因此可 以提高检测的灵敏性； 组合在 一起较好地用于重型、 危重型患者的诊断和早期 预警。 权利要求书2页 说明书26页 附图7页 CN 115478117 A 2022.12.16 CN 115478117 A 1.检测多种miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述miRNA标志物为miR ‑nsp3‑3p以及 以下三种miRNA标志物中的至少一种： miR ‑7‑5p、 miR‑24‑3p和miR‑223‑3p， 所述检测miRNA 标志物的引物组中包括第一逆转录引物、 第一PCR上游引物和第一PCR下游引物， 第一逆转 录引物序列如SEQ  ID NO.1所示， 第一PCR上游引物序列如SEQ  ID NO.2所示， 第一PCR下游 引物序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的检测多种miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述检测miRNA 标志物的引物组中还 包括如下 所述的至少一种引物组合； a)检测miRNA标志物的第二逆转录引物、 第二PCR上游引物和第二PCR下游引物， 第二逆 转录引物序列如SEQ  ID NO.5所示， 第二PCR上游引物序列如SEQ  ID NO.6所示， 第二PCR下 游引物序列如SEQ  ID NO.7所示； b)检测miRNA标志物的第三逆转录引物、 第三PCR上游引物和第三PCR下游引物， 第三逆 转录引物序列如SEQ  ID NO.9所示， 第三PCR上游引物序列如SEQ  ID NO.10所示， 第三PCR下 游引物序列如SEQ  ID NO.11所示； c)检测miRNA标志物的第四逆转录引物、 第四PCR上游引物和第四PCR下游引物， 第四逆 转录引物序列如SEQ  ID NO.13所示， 第四PCR上游引物序列如SEQ  ID NO.14所示， 第四PCR 下游引物序列如SEQ  ID NO.15所示。 3.根据权利要求1或2所述的检测多种miRNA标志物的引 物组， 其特征在于， 所述miRNA 标志物为 miR‑nsp3‑3p、 miR‑7‑5p、 miR‑24‑3p和miR‑223‑3p， 所述引物组包括以下任 意一种 组合： 1)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑7‑5p的第二逆转录引物、 第二PCR上游引物、 第二PCR下游引物； 2)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑24‑3p的第三逆转录引物、 第三PCR上游引物、 第三PCR下游引物； 3)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑223‑3p的第四逆转录引物、 第四PCR上游引物、 第四PCR下游引物； 4)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑7‑5p的第二逆转录引物、 第二PCR上游引物、 第二PCR下游引物+检测miR ‑24‑3p的第三 逆转录引物、 第三PCR上游引物、 第三PCR下游引物； 5)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑7‑5p的第二逆转录引物、 第二PCR上游引物、 第二PCR下游引物+检测miR ‑223‑3p的第四 逆转录引物、 第四PCR上游引物、 第四PCR下游引物； 6)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑24‑3p的第三逆转录引物、 第三PCR上游引物、 第三PCR下游引物+检测miR ‑223‑3p的第 四逆转录引物、 第四PCR上游引物、 第四PCR下游引物； 7)检测miR ‑nsp3‑3p的第一逆转录引物、 第一PCR上游引物、 第一PCR下游引物+检测 miR‑7‑5p的第二逆转录引物、 第二PCR上游引物、 第二PCR下游引物+检测miR ‑24‑3p的第三 逆转录引物、 第三PCR上游引物、 第三PCR下游引物+检测miR ‑223‑3p的第四逆转录引物、 第 四PCR上游引物、 第四PCR下游引物。 4.根据权利要求3所述的检测多种miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述引物组中权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478117 A 2还包括有分别用于检测miR ‑nsp3‑3p、 miR‑7‑5p、 miR‑24‑3p和miR‑223‑3p基因的第一至第 四探针， 第一探针序列如SEQ  ID NO.4所示， 第二探针序列如SEQ  ID NO.8所示， 第三探针序 列如SEQ ID NO.12所示， 第四探针序列如SEQ  ID NO.16所示。 5.检测miRNA标志物 的引物组在制备用于早期预警新型冠状病毒中重型、 危重型病例 的试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述检测miRNA标志物的引物组为权利要求1 ‑4任一所述 的引物组。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒中还包括有用于检测内参基因 miRNA标志物的引物组， 引物组包括有第五PCR上游引物和第五PCR上游引物， 第五PCR上游 引物序列如SEQ  ID NO.17所示， 第五PCR下游引物序列如SEQ  ID NO.18所示。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述用于检测内参基因miRNA标志物的引 物组中还 包括有用于检测内参基因的第五探针， 第五探针序列如SEQ  ID NO.19所示。 8.用于早期预警新型冠状病 毒中重型、 危重型病例的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 为染料法试剂盒， 所述染料法试剂盒包括有权利要求1 ‑3和权利要求6所述的引物组； 或 所述试剂盒为探针法试剂盒， 所述探针法试剂盒包括有权利要求1 ‑3所述的引物组和 权利要求 4所述的探针， 以及权利要求6所述的引物组和权利要求7 所述的探针。 9.根据权利要求8所述的用于早期预警新型冠状病 毒中重型、 危重型病例的试剂 盒， 其 特征在于， 所述试剂盒中， 还包括有PCR反应液、 阳性质控品、 阴性质控品和空白对照； 所述 PCR反应液中， 包含有DEPC水、 qPC R缓冲液、 MgCl2、 核苷酸混合液、 逆转录酶、 D NA聚合酶和染 料试剂； 所述染料 试剂为ROX参比染料或SYBR  Green荧光染料。 10.权利要求8或9所述的用于早期预警新型冠状病毒中重型、 危重型病例的试剂盒的 使用方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.取外周血 血清样本； S2.提取样本的总RNA， 以总RNA为扩增模板； S3.分别配制血清样本、 阳性质控品、 阴性质控品和空白对照的PCR反应 体系； S4.以各PCR反应 体系进行PCR反应； S5.依据PCR反应结果的扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴 阳性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478117 A 3