(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210511052.X (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 深圳市血 液中心 （深圳市输血医学 研究所） 地址 518000 广东省深圳市福田区华 富街 道泥岗西路梅岗南 街2号 (72)发明人 邓志辉　甄建新　宁理　杨智超　 邹红岩　喻琼　 (74)专利代理 机构 北京恒律知识产权代理有限 公司 11416 专利代理师 王术娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种KIR基因分型检测引物组和试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种KIR基因分型检测引物组 和试剂盒， 属于生物医学技术领域。 本发明在已 测定中国人群KIR等位基因多态性及SNPs信息的 基础上， 同时参考国际IPD ‑KIR数据库收录的KIR 基因全长序列， 针对KIR基因家族中的16种KIR基 因及2种2DS4亚型， 设计得到具有相近退火温度 的18对引物， 并引入一对内参引物制备得到一种 鉴定KIR基因有无的检测试剂盒。 所述试剂盒的 检测结果与测序分型结果相一致， 可准确鉴定受 检者携带的KIR基因及其基因型， 在群体遗传学、 疾病关联、 骨髓移植等领域具有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书27页 序列表6页 附图2页 CN 114807387 A 2022.07.29 CN 114807387 A 1.一种KIR基因分型检测引物组， 其特征在于， 包括19对特异性PCR引物， 分别为扩增16 种KIR基因、 2种2D S4亚型和HGH基因的引物组； 所述引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:1～SEQ  ID NO:38所示的引物。 2.权利要求1所述KIR基因分型检测引物组在制备 KIR基因分型检测试剂盒中的应用。 3.一种KIR基因分型的检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述KIR基因分型检测 引物组和检测试剂。 4.根据权利要求3所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂包括： 10 ×PCR Buffer、 dNTP、 镁离 子和Taq DNA聚合酶。 5.一种KIR基因分型的方法， 包括以下步骤： 1)将权利要求1所述引 物组中扩增16种KIR基因和2种2DS4亚型的引 物分别与HGH基因 引物、 待测样本基因组DNA、 其他PCR组分和ddH2O混合配制检测反应体系； 将HGH基因引物、 ddH2O和其他PCR组分 混合配制阴性对照反应 体系； 2)将所述检测反应 体系和阴性对照反应 体系分别进行PCR扩增， 得到PCR产物； 3)检测所述PCR产物中是否含有目标基因片段， 根据各基因扩增结果判断待测样本的 KIR基因型。 6.根据权利 要求5所述方法， 其特征在于， 所述检测反应体系为10.0 μL， 包括以下成分： 10×PCR Buffer 1.0μL、 2.5mM  dNTP 0.8 μL、 15.0mM  MgCl21.0μL、 5U/μL  Taq DNA聚合酶 0.15 μL、 10 μM每种KIR基因上下游引物各0.5 μL、 10 μM  HGH基因上下游引物各0.1μL、 基因组 DNA 2.0 μL和d dH2O 3.85 μL。 7.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述阴性对照反应体系为10.0μL， 包含以下 成分： 10×PCR Buffer 1.0 μL、 2.5 mM dNTP 0.8 μL、 15.0 mM MgCl2 1.0 μL、 5U/ μL  Taq DNA聚 合酶0.15 μL、 10 μM  HGH基因上 下游引物各0.1 μL和d dH2O 6.85 μL。 8.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应程序如下： 95℃  3min； 95 ℃ 15Sec， 68℃  15Sec， 72℃  45Sec， 30个循环； 72℃  10min。 9.根据权利要求5～8任意一项所述方法， 其特征在于， 所述检测PCR产物是否含有目标 片段的方法包括 琼脂糖凝胶电泳法。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807387 A 2一种KIR基因分型检测引物组和试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物医学技 术领域， 具体涉及一种KIR基因分型检测引物组和试剂盒。 背景技术 [0002]表达于自然杀伤(natural  killer,NK)细胞和部分活化的T细胞表面的杀伤细胞 免疫球蛋白样受体(killer  immunoglobulin ‑like receptor,KIR)， 属于免疫球蛋白超家 族。 基于胞外结构域的数量， 可分为2个亚家族： 具有2个胞外结构域的KI R2D及具有3个胞外 结构域KIR3D； 根据胞浆区的长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)的有无， KIR功能上 可分为抑制型KIR、 激活型KIR。 KIR识别并结合靶细胞表面的人类白细胞抗原(HLA) Ⅰ类分 子， 传递激活/抑制 信号， 共同调节NK细胞的活性， 在移 植免疫、 肿瘤免疫和机体抗感染中均 发挥重要作用。 [0003]编码KIR分子的KIR基因家族， 定位于人类第19号染色体上， 呈共显性表达， 包括14 种功能性KIR基因(2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DL5、 2DS1、 2DS2、 2DS3、 2DS4、 2DS5、 3DL1、 3DL2、 3DL3、 3DS1)和2种假基因(2DP1、 3DP1)。 2DS4基因可细分为2DS4 ‑Deleted、 2DS4 ‑Normal两种 亚型[1]， 其中2DS4 ‑Deleted存在22bp的缺失， 引起阅读 框移位， 编码截短的多肽不能正常表 达于细胞表面， 也不能传递激活信号； 而2DS4 ‑Normal不存在22bp的缺失， 能表达完整的 2DS4分子并传递激活信号； 由于2DS4 ‑Deleted、 2DS4 ‑Normal亚型的表达和 功能上的差异， 区分这两种不同亚型十分必要。 [0004]KIR基因不仅存在等位基因水平的多态性， 还存在单倍体 组成的多态性， 即每一种 单倍体所携带的KI R基因的种类和数量均不同。 当前， 国际上普遍采用序列特异性引物 ‑PCR (sequence  specific  primers‑PCR,PCR‑SSP)、 流式磁珠 ‑序列特异性寡核苷酸探针杂交 (flow‑reverse sequence  specific  oligonucleotide  probe,Flow ‑rSSO)等分子生物学 方法检测KIR基因 的有无(presence  or absence)。 KIR基因 的PCR‑SSP检测方法， 无需大型 贵重设备， 实验操作简单， 结果判读直观。 Flow ‑rSSO方法检测KIR基因， 具有DNA用量少、 适 合于高通量化等特点。 当前， KIR基因有无的检测在临床骨髓移植组织配型中正逐步开展， 但尚未开展KIR基因的检测试剂或方法的室间质控及能力验证。 申请人曾对不同厂家的 PCR‑SSP、 Flow ‑rSSO商品化试剂盒的检测结果进行平行对比， 在77例样本的Flow ‑rSSO试剂 盒检测结果中， 两例样本的2DL2检测结果存在假阳性(磁珠荧光校准值略高于临界值)[2]； 厂家调整了检测2DL2基因的磁珠杂交荧光信号峰的临界值后进行复检， 则与PCR ‑SSP方法 的检测结果 一致。 [0005]基于低分辨水平KIR基因有无的多态性， 汉族健康无关个体的KIR群体遗传学数据 还存在较大的差异。 以KIRAA单倍体组合型的检出频率为例， 有研 究报道KIRAA的检出频率 为58.7％[3]， 而有的研究报道 为33％[4]。 即使同一地域的人群， 不同研究者采用不同方法得 到的结果 也存在较大差异， 这可能与采用的KIR基因检测试剂的质量或检测方法有关。 [0006]尽管当前国际上已有文献报道了PCR ‑SSP KIR基因检测的方法[5， 6]， 如Martin等[5] 针对每种KI R基因， 采用2对 KIR基因特异性PCR引物分别进行扩增； 但KIR基因扩增过程中并说　明　书 1/27 页 3 CN 114807387 A 3