(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210515361.4 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 江苏谱新 生物医药有限公司 地址 215104 江苏省苏州市吴中经济技 术 开发区越溪街道吴中大道1463号越旺 智慧谷A4 号楼整幢 (72)发明人 刘丽美　李查　张天扬　张煜晗　 郑孟韬　蔡宇卿　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 E.coli残留DNA检测试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明涉及G01N33/68领域， 具体为E.coli 残留DNA检测试剂盒及其使用方法。 本发明试剂 盒 至 少包 括 E .c o l i  DN A 定 量 参 考品 、 E.coliPrimer ⪻MIX、 qPCR  Reaction  Buffer、 DNA稀释液， 采用qPCR ‑荧光探针法， 在qPCR技术 的基础上利用荧光探针原理， 定量检测样本中 E.coli残留DNA， 简化qPCR反应操作的反应液配 置时的操作步骤， 检测快速， 专一性强， 性能可 靠， 最低检测限可以达 到fg水平。 权利要求书2页 说明书9页 CN 115216550 A 2022.10.21 CN 115216550 A 1.E.coli残留DNA检测试剂盒， 其特征在于， 至少包括E.coli  DNA定量参考品、 E.coliPrimer&Probe  MIX、 qPCR Reaction Buffer、 DNA稀释液。 2.根据权利要求1所述的E.coli残留DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述E.coliPrimer& Probe MIX至少包括E CDNA‑F4、 ECDNA‑R3、 ECDNA‑probe‑F4。 3.一种采用权利要求1或2所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 包 括： 试剂前处 理、 qPCR反应液处 理、 qPCR程序参数设置、 qPCR结果分析。 4.根据权利要求3所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述试剂前 处理具体包括以下步骤： S1、 将E.coli  DNA定量参考品、 DNA稀释液放在冰上融化， 待完全融化后， 轻微振荡混 匀， 瞬时离心； S2、 取6支干净的1.5ml离心管， 分别标记为STD0， STD1， STD2， STD3， STD4， STD5； S3、 在STD0管中用DNA稀释液将E.coli  DNA定量参考品稀释10倍， 得到STD0， 振荡混匀 后短时间快速 离心10s； S4、 在STD1， STD2， STD3， STD4， STD5管中分别加 入10 μL STD0， STD1， STD2， STD3， STD4和 90 μLDNA稀释液。 5.根据权利要求3所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述qPCR反 应液处理具体包括以下步骤： S1、 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量， 计算所需反应孔数； S2、 根据反应孔数计算测试 所需的qPCR  MIX总量； S3、 将E.coliPrimer&Probe  MIX、 qPCR Reaction  Buffer取出后放在冰上融化， 轻微振 荡混匀， 按照体积比配制qPCR  MIX； S4、 进行各反应孔加样， 加样完成后每孔总体积为20μL， 将孔板轻微振荡混匀， 短时间 快速离心10s后放入qPCR仪 。 6.根据权利要求5所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述步骤S1 中反应孔数的计算公式为： 反应孔数＝(标准曲线的浓度梯度个数+1个无模板对照NTC+待 测样本数) ×平行样品数。 7.根据权利要求5所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述步骤S2 中qPCR MIX总量的计算公式为： qPCR  MIX总量＝(反应孔数+2) ×20 μL。 8.根据权利要求5所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述步骤S4 中qPCR仪 选自ABI PRISM 7500、 CFX96、 Linegene 9600plu。 9.根据权利要求3所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述qPCR程 序参数设置具体包括以下步骤： S1、 创建实验反应程序， 设置PCR反应程序如下： 95℃预变性10min； 95℃15s， 60℃1min， 40个循环， 反应 体积20 μL； S2、 创建实验反应板， 点击Select  Fluorophores选择荧光FAM； (a)在反应板图表中， 选 择样品孔， 在Sample  Type中下拉选择Unknow， 勾选荧光FA M， Target  Name进行命名， 输入每 个样品的重复次数及Sample  Name； (b)在反应板图表中， 选择标曲孔， 在Sample  Type中下 拉选择Standard， 勾选荧光FA M， Target  Name命名E.coli ‑DNA， 输入每个稀释梯度的重复次 数及Sample  Name； 并且分别在STD1， STD2， STD3， STD4， STD5的Concentration一栏进行赋权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115216550 A 2值， 选择单位fg； S3、 点击Star t Run， 选择保存路径。 10.根据权利 要求3所述的试剂盒检测E.coli残留DNA的方法， 其特征在于， 所述qPCR结 果分析具体包括以下步骤： S1、 点击资料分析视窗Quantitati on， 可读取 标准曲线的斜 率、 截距、 扩增效率、 R2； S2、 在视窗Quantitation  Data中， SQ  Mean一栏可读取无模板对照NTC、 待测样本检测 值， 单位为fg/ μL； S3、 无模板对照NTC检测结果应为 N/A或Ct值大于标准曲线最低浓度Ct均值。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115216550 A 3