(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210508577.8 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 郭爱珍　徐恩红　胡长敏　陈颖钰　 陈曦　祁明普　易萍　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) C12R 1/35(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测BRDC七种病原体的实时荧光 定量PCR引物对和探 针组合 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测牛呼吸疾病综 合征七种病原 体的实时荧光定量PCR引物对和探 针组合， 该套引物探针能够特异性的扩增出牛支 原体的oppD/ F基因、 牛多杀性巴氏杆菌的o mpH基 因、 牛溶血曼氏杆菌的GCP基因、 牛传染性鼻气管 炎病毒的gB基因、 牛合胞体病毒的N基因、 牛副流 感病毒3型a基因型的N基因、 牛副流感病毒3型c 基因型的N基因， 可同时用于上述七种病原体的 检测以提高检测效率。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图5页 CN 115044686 A 2022.09.13 CN 115044686 A 1.用于检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR引物对和探针组合， 其 特征在于， 所述七种病原体为牛支原体(Mycoplasma  bovis)、 牛多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella  multocida)、 牛溶血曼氏杆菌(Mannh eimia haemolytica)、 牛传染性鼻气管 炎病毒(Infectious  bovine rhinotracheitis  virus)、 牛合胞体病毒(Bovine   respiratory  syncytial  virus)、 牛副流感病毒3型a基因型(Bovine  parainfluenza   virus types 3a)和牛副流感病毒3型c基因型(Bovi ne parainfluenza virus types 3c)， 所述引物对和探针组合 为： 用于检测牛支原体的上游引物序列如SEQ  ID No.1所示， 下游引物序列如SEQ  ID No.2 所示， 探针序列如SEQ  ID No.3所示； 用于检测牛多杀性巴氏杆菌的上游引物序列如SEQ  ID No.4所示， 下游引物序列如SEQ   ID No.5所示， 探针序列如SEQ  ID No.6所示； 用于检测牛溶血曼氏杆菌的上游引物序列如SEQ  ID No.7所示， 下游引物序列如SEQ   ID No.8所示， 探针序列如SEQ  ID No.9所示； 用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的上游引物序列如SEQ  ID No.10所示， 下游引物序列 如SEQ ID No.11所示， 探针序列如SEQ  ID No.12所示； 用于检测牛合胞体病毒的上游引物序列如SEQ  ID No.13所示， 下游引物序列如SEQ  ID  No.14所示， 探针序列如SEQ  ID No.15所示； 用于检测牛副流感病毒3型a基因型的上游引物序列如SEQ  ID No.16所示， 下游引物序 列如SEQ ID No.17所示， 探针序列如SEQ  ID No.18所示； 用于检测牛副流感病毒3型c基因型的上游引物序列如SEQ  ID No.19所示， 下游引物序 列如SEQ ID No.20所示， 探针序列如SEQ  ID No.21所示。 2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记荧光报 告基团， 3 ’端标记荧 光淬灭基团。 3.根据权利要求2所述的引物对和探针组合， 其特征在于， 检测牛支原体的探针标记的 荧光报告基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ 1； 检测牛多 杀性巴氏杆菌的探针标记的荧光报告 基团为Texas  red， 荧光淬灭基团为BHQ2； 检测牛溶血曼氏杆菌的探针标记的荧光报告基团 为HEX， 荧光淬灭基团为BHQ1； 检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针标记的荧光报告基团为 CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2； 检测牛合胞体病毒的探针标记的荧光报告基团为CY5.5， 荧光淬 灭基团为BHQ2； 检测牛副流感病毒3型a基因型的探针标记的荧光报告基团为Texas  red， 荧 光淬灭基团为BHQ2； 检测牛副流 感病毒3型c基因型的探针标记的荧光报告基团为HEX， 荧光 淬灭基团为BHQ1。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物对和探针组合在非诊断目的检测牛呼吸疾病综合征 七种病原体中的应用， 所述七种病原体为牛支原体、 牛多杀性巴氏杆菌、 牛溶血曼氏杆菌、 牛传染性鼻气管炎病毒、 牛合胞体病毒、 牛副流感病毒3型a基因型和牛副流感病毒3型c基 因型。 5.权利要求1 ‑3任一项所述的引物对和探针组合在制备检测牛呼吸疾病综合征七种病 原体的试剂盒中的应用。 6.一种检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的试剂盒， 该试剂盒包含权利要求1 ‑3任一 项所述的引物对和探针组合。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044686 A 27.一种非诊断目的检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR方法， 其特 征在于： 包括 向反应体系中加入权利要求1 ‑3任一项所述的引物对和探针组合进行TaqMan 实时荧光定量PCR扩增的步骤。 8.如权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 采用三管联合的方法， 所述反应体系如 下： 管1： 2×Probe PCR Master Mix 10μL， 牛多杀性巴氏杆菌的上下游引物终浓度 250nmol/L； 牛溶血曼氏杆菌的上下游引物终浓度为200nmol/L； 牛多杀性巴氏杆菌的探针 终浓度为350nmol/L， 牛溶血曼氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L， 模板5 μL， 双蒸水补足20 μ L； 管2： 2×Probe PCR Master Mix 10 μL， 牛合胞体病毒的上下游引物终浓度250nmol/L； 牛副流感病毒3型a基因型的上下游引物终浓度为400nmol/L； 牛副流感病毒3型c基因型的 上下游引物终浓度为350nmol/L； 牛合胞体病毒的探针终浓度为350nmol/L， 牛副流 感病毒3 型a基因型的探针终浓度为250nmol/L， 牛副流 感病毒3型c基因型的探针终浓度为300nmol/ L， 模板5 μL， 双蒸水补足20 μL； 管3： 2×Probe PCR Master Mix 10 μL， 牛支原体的上下游引物终浓度250nmol/L； 牛传 染性鼻气管炎的上下游引物终浓度为350nmol/L； 牛支原体的探针终浓度为350nmol/L， 牛 传染性鼻气管炎病毒的探针终浓度为25 0nmol/L， 模板 5 μL， 双蒸水补足20 μL。 9.如权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 3管在同一程序下扩增， 反应程序为： 95 ℃预变性30s， 1个循环； 95℃变性10s， 60℃退火30s， 40个循环， 每个循环结束时自动收集荧 光信号。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044686 A 3