(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210512509.9 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 中国科学院合肥物质科 学研究院 地址 230031 安徽省合肥市蜀山湖路3 50号 申请人 嘉必优生物技 术 （武汉） 股份有限公 司 (72)发明人 吴金勇　王静静　陈祥松　刘伟伟　 李忠奎　袁丽霞　李翔宇　姚建铭　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 费雯 (51)Int.Cl. C12N 9/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/54(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/48(2006.01) C12P 19/26(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应 用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体公开了一种 胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用。 所述胞 苷单磷酸激酶突变体与SEQ  ID NO:1具有至少 90％的核苷酸序列一致性， 且包含以下至少一个 或多个位置的突变， 所述的突变位点包括SEQ  ID  NO:1的第3、 4、 5、 74、 77、 79、 85、 170或173位中的 至少一个突变位点。 本发明采用定点突变提高了 胞苷单磷酸激酶的热稳定性， 将热稳定性佳的胞 苷单磷酸激酶突变体构建到菌株中， 在3 ’ ‑唾液 酸乳糖的酶催 化合成中， 提高了酶催 化反应的速 率和减少了酶活力的损失， 使得可以获得更高产 量的3’ ‑唾液酸乳糖， 并进一步提升了底物的转 化率， 缩短了生产周期， 降低了生产成本 。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图3页 CN 114736884 A 2022.07.12 CN 114736884 A 1.一种胞苷单磷酸激酶突变体， 其特征在于， 所述胞苷单磷酸激酶突变体与SEQ  ID  NO:1具有至少90％的核苷酸序列一致性， 且包含以下至少一个或多个位置的突变， 所述的 突变位点包括SEQ  ID NO:1的第3、 4、 5、 74、 77、 79、 85、 170或173位中的至少一个突变位点， 所述的突变为在所述的突变位 点上发生取代、 插 入或删除一个或多个氨基酸残基。 2.如权利要求1所述的胞苷单磷酸激酶突变体， 其特征在于， 所述的突变为取代突变， 至少包括以下一个或多个氨基酸残基的取代： 第3位丙氨酸被脯氨酸取代； 或 第4位异亮氨酸被甘 氨酸取代； 或 第8位丙氨酸被天 冬酰胺取代； 或 第74位苏氨酸被甘 氨酸取代； 或 第77位天冬酰胺被组氨酸取代； 或 第79位谷氨酰胺被天 冬酰胺取代； 或 第85位谷氨酸被天 冬酰胺取代； 或 第170位天 冬酰胺被甘 氨酸取代； 或 第173位精 氨酸被丝氨酸取代。 3.如权利要求2所述的胞苷单磷酸激酶突变体， 其特征在于， 所述的突变选自如下任一 组合： 1)包含第77位天冬酰胺被组氨酸取代和第79位谷氨酰胺被天 冬酰胺取代， 或； 2)包含第77位天冬酰胺被组氨酸取代和第173位精 氨酸被丝氨酸取代， 或； 3)包含第79位谷氨酰胺被天 冬酰胺取代和第173位精 氨酸被丝氨酸取代， 或； 4)包含第77位天冬酰胺被组氨酸取代、 第79位谷氨酰胺被天冬酰胺取代和第173位精 氨酸被丝氨酸取代。 4.一种检测如权利要求1所述的胞苷单磷酸激酶突变体的引物， 其特征在于， 所述引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2～SEQ ID NO:23所示。 5.一种基因， 其特 征在于， 基因编码如权利要求1～3所述的胞苷单磷酸激酶突变 体。 6.一种质粒， 其特征在于， 所述质粒包括如权利要求1～3所述的胞苷单磷酸激酶突变 体。 7.一种宿主细胞， 其特征在于， 宿主细胞包括如权利要求5所述的基因或权利要求6所 述的质粒。 8.如权利要求1～3所述的胞苷单磷酸激酶突变 体在制备3 ’ ‑唾液酸乳糖中的应用。 9.如权利要求1～3所述的胞苷单磷酸激酶突变体在提高胞苷单磷酸激酶热稳定性能 中的应用。 10.一种促进3 ’ ‑唾液酸乳糖催化活性的方法， 其特征在于， 在生物酶法催化体系中， 使 用如权利要求1～3所述的胞苷单磷酸激酶突变 体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736884 A 2一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 尤其是涉及一种胞苷单磷酸激酶突变体及 其基因和应 用。 背景技术 [0002]胞苷单磷酸激酶(C ytidine monophosphate  kinase， CMK)是核苷单磷酸激酶家族 的重要成员。 CMK在 核苷酸合成代谢中起关键作用， 催化磷酸基团从三磷酸腺苷(Adenosine   triphosphate， ATP)转移到胞苷单磷酸(Cytidine  monophosphate， CMP)， 生成胞苷二磷酸 (Cytidine  diphosphate， CDP)。 CDP随后被磷酸化以生成胞苷三磷酸(Cytidine   triphosphate， CTP)。 [0003]3’ ‑唾液酸乳糖(3 ’ ‑sialyllact ose， 3’ ‑SL)是母乳中含量丰富的酸性寡糖成分之 一， 其含有益生元， 具有抗病毒、 抗病原菌粘附、 促进认知、 促进 大脑发育和免疫调节等重要 生理功能。 [0004]经研究表明， 胞苷 单磷酸激 酶(CMK)在酶促合成3 ’ ‑SL过程中起着重要作用， CTP再 生是酶促合成3 ’ ‑SL的重要途径。 CM K和多聚磷酸激酶(Polyphosphate  kinase， PPK)以多聚 磷酸为底物， 催化CMP转化为CTP。 但在CTP再生过程中， 发现CMK酶的热稳定性较差， 影 响CTP 再生效果， 从而影响3 ’ ‑唾液酸乳糖的合成。 发明内容 [0005]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种胞苷单磷酸激酶突 变体及其基因和应用。 [0006]为实现上述目的， 本发明采取的技 术方案为： [0007]第一目的， 本发明提供了一种胞苷单磷酸激酶突变体， 所述胞苷单磷酸激酶突变 体与SEQ ID NO:1具有至少90％的核苷酸序列一致性， 且包含以下至少一个或多个位置的 突变， 所述的突变位点包括SEQ  ID NO:1的第3、 4、 5、 74、 77、 79、 85、 170或173位中的至少一 个突变位点， 所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、 插入或删除一个或多个氨基酸 残基。 [0008]酶的热稳定性是评价酶生物催化剂的一个重要指 标， 热稳定性高有利于提高反应 速率和减少酶活力的损失。 由于CMK酶在CTP再生过程中热稳定性较差， 影响了3 ’ ‑唾液酸乳 糖的合成， 因此， 本发明对胞苷单磷酸激酶(CMK)进行分子 改造， 得到了热稳定性较高的胞 苷单磷酸激酶突变体， 进而提高3 ’ ‑唾液酸乳糖合成的反应速率， 缩短其生产周期， 降低了 生产成本 。 [0009]为了提供胞苷单磷酸激酶的热稳定性， 对胞苷单磷酸激酶进行分析改造， 在PDB数 据库中选择CMK(PDB数据库登录号:1KDO)作为CMK突变位点的模板， 本发 明人经过大量的实 验， 对胞苷单磷酸激酶多个位点 改造， 最终获得11个突变位点， 即在SEQ  ID NO:1基础上的 对第3、 4、 5、 74、 76、 77、 79、 85、 170、 173或22 3位至少一个位点进行突变。 其中在SEQ  ID NO:1说　明　书 1/8 页 3 CN 114736884 A 3