(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210502134.8 (22)申请日 2022.05.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114592076 A (43)申请公布日 2022.06.07 (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 专利权人 广东梁氏水产种业有限公司 (72)发明人 张勇　韩崇　李桂峰　李水生　 韩林强　梁健辉　林浩然　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽(51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 112746111 A,2021.0 5.04 CN 112262794 A,2021.01.26 宋易等.生长相关 分子标记在翘嘴鳜五代中 的富集. 《水生 生物学报》 .2016,第40卷(第5期), 审查员 谢庆宁 (54)发明名称 斑鳜雄性分子标记引物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种斑鳜雄性分子标记引物， 所述引物为引物对N1或引物对 N2， 所述引物对N1 包括Contig ‑1上游引物和Contig ‑1下游引物， 所 述引物对N2包括Contig ‑2上游引物和Contig ‑2 下游引物， 所述Contig ‑1上游引物、 Contig ‑1下 游引物、 Contig ‑2上游引物和Contig ‑2下游引物 的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO： 1~SEQ ID NO： 4 所示。 该引物可对斑鳜的性别进行快速准确地鉴 定。 还公开了一种鉴别斑鳜性别的方法， 该方法 耗时短， 效率高。 本发明还进一步公开了上述斑 鳜雄性分子标记引物、 方法在斑鳜全雌性育种以 及全雌杂交鳜育种方面的应用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114592076 B 2022.08.16 CN 114592076 B 1.一种雄性斑鳜特异性分子标记引物， 其特征是： 所述引物为引物对N1或引物对N2， 所 述引物对N1包括Contig ‑1上游引物和Contig ‑1下游引物， 所述引物对N2包括Contig ‑2上游 引物和Contig ‑2下游引物， 其中所述Contig ‑1上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述Contig ‑1下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示， 所述Contig ‑2上游引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述Co ntig‑2下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 2.一种斑鳜性别鉴定的方法， 包括以下步骤： （1） 提取斑鳜DNA样品； （2） 以步骤 （1） 中的DNA样品为模板， 采用 权利要求1所述的引物对N1或引物对N2进行 PCR扩增， 扩增反应结束后进 行电泳检测， 若电泳结果显示扩增产 物具有特异性DNA条带， 此 时所检测的斑鳜DNA样品为雄性斑鳜， 若电泳结果显示扩增产物不具有特异性DNA条带， 此 时所检测的斑鳜DNA样品为雌性斑鳜。 3.根据权利 要求2所述的斑鳜性别鉴定的方法， 其特征是： 步骤 （1） 中斑鳜DNA样品采用 柱式离心法提取。 4.根据权利要求2所述的斑鳜性别鉴定的方法， 其特征是： 步骤 （2） 中采用引物对N1或 引物对N2进行PCR扩增时， 20 μL  PCR反应体系 包括DNA50ng， 引物对N1上、 下游引物各0.8 μL 或引物对N2上、 下游引物各0.8 μL， 2 ×TaqMasterMix10 μL， 不足20 μL部分用d dH2O补齐。 5.根据权利要求2所述的斑鳜性别鉴定的方法， 其特征是： 步骤 （2） 中采用引物对N1或 引物对N2进行PCR扩增时， PCR反应程序是： 首先94℃预变性2min； 再94℃变性30s， 56℃退火 30s， 72℃延伸3 0s， 共35个循环； 再72℃终延伸5mi n。 6.根据权利要求2所述的斑鳜性别鉴定的方法， 其特征是： 步骤 （2） 中进行电泳检测时， 采用质量百分含量 为1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段的长度。 7.权利要求1所述 雄性斑鳜特异性分子标记引物在斑鳜全雌性育种方面的应用。 8.权利要求2所述方法在斑鳜全雌性育种方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592076 B 2斑鳜雄性分子标记引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于鱼类性别鉴定技术领域， 具体涉及一种斑鳜雄性分子标记引物及 其应 用。 背景技术 [0002]近年来， 高通量测 序技术发展迅猛， 为分子标记开发提供了一种新的高效手段， 目 前越来越多的高通量测序方法已成功在多种鱼类物种中开发出性别特异分子标记。 如利用 RNA‑seq成功在西方食蚊鱼中发现了性别标记， 利用简化基因组技术在尼罗罗非鱼 （Oreochromisniloticus） 、 欧洲鲈鱼 （Dicentrarchuslabrax） 、 大比目鱼 （Alaskan   halibut） 以及鲢鱼 （Hypophthalmichthysmolitrix） 中发现了性别标记， 利用全基因组测序 及重测序技术在大西洋鳕鱼 （Gadusmorhua） 、 蓝鳍金枪鱼 （Thunnusthynnus） 、 大黄鱼 （Larimic hthyscrocea） 以及乌鳢 （C hannaargus） 等物种中开发出性别特异标记。 [0003]斑鳜 （Siniperc ascherzeri） ， 属于鲈形目 （Perciformes） ， 鳜科 （Sinipercidae） ， 鳜属 （Siniperca） ， 也称西江斑鳜。 鳜为我国特有淡水名贵鱼类， 其肉质鲜美， 营养丰富， 无 肌间刺， 深受国内外消费者喜爱。 相比于翘嘴鳜， 斑鳜更易驯食冰鲜饲料， 更易于实现饲料 化养殖， 而且斑鳜与翘嘴鳜的杂交种表现出两种鳜鱼的优良特性， 养殖 前景广阔。 [0004]已有多项研究表明鳜鱼是XY染色体性别决定型， 因此通过对雌雄基因组进行测 序 分析， 并发现雄性基因组有 许多特异DNA片段， 通过PCR验证证实斑鳜性别决定为雄性异配。 而鳜鱼单性育种首先需要得到伪雄鱼， 全雌杂交鳜也需要获得XX伪雄斑鳜。 如果没有分子 标记， 只能通过测交实验来判别父本的性 染色体组成， 即是XX伪雄鱼还是正常XY雄鱼。 鳜鱼 比较难从外部形态上区分性别， 且测交亲本单独养殖需要占用大量养殖资源， 且耗时较长， 所以用测交的方法耗时， 费力又费资源。 截止到现在， 国内外尚无能够成功 鉴定斑鳜遗传性 别的分子标记的报道， 因此， 开发一种准确 鉴定遗传雄性的分子标记在斑鳜以及杂交鳜单 性育种中具有极大的生产应用价 值。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种斑鳜雄性分子标记引物， 该引物能在分子水平上鉴别 雄性斑鳜。 [0006]本发明目的还在于提供一种斑鳜性别鉴定的方法， 该 方法耗时短， 检测结果 准确。 [0007]本发明的最后一个目的在于提供上述引物或方法在斑鳜全雌性育种以及全雌杂 交鳜 （斑鳜 ♂X翘嘴鳜♀） 育种方面的应用。 [0008]本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现： 一种斑鳜雄性分子标记 引物， 所述引物为引物对N1或引物对N2， 所述引物对N1包括Contig ‑1上游引物和Contig ‑1 下游引物， 所述引物对N2包括Contig ‑2上游引物和Contig ‑2下游引物， 其中所述Contig ‑1 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述Contig ‑1下游引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 2所示， 所述Contig ‑2上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述Contig ‑2下说　明　书 1/6 页 3 CN 114592076 B 3