(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210501628.4 (22)申请日 2022.05.10 (71)申请人 国科温州研究院 （温州生物材 料与 工程研究所） 地址 325038 浙江省温州市龙湾区永中街 道金联路1号 (72)发明人 赵远锦　张乐翔　叶方富　商珞然　 余筠如　 (74)专利代理 机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 专利代理师 戴朝荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G06F 8/61(2018.01) G16B 25/20(2019.01) G16B 50/00(2019.01) (54)发明名称 一种光介导相变溶胶微滴数字PCR技术对前 列腺癌外泌体microRNA的检测方法 (57)摘要 本发明提供一种基于可控近红外光介导的 相变溶胶微滴数字PCR技术对前列腺癌外泌体 microRNA的检测方法， 包 括如下步骤： S1、 激光器 可控输出模块包括近红外光激光器、 电压线性放 大器、 Arduino电路板、 Arduino  IDE开源平台； 近 红外光激光器具有I/O接口， 近红外光激光器内 部具开关电源， 外部具有激光光纤探头； S2、 制备 光热纳米材料、 纳米颗粒和SiO2的光热复合材 料； 将光热复合材料混入温敏性水凝胶， 最后通 过微流控微滴形成芯片； 所复合水凝胶还包含茎 环形式逆转录引物、 特异性PCR引物以及taqman 特异性荧光探针； S3、 将微滴群置于激光光纤探 头下方， 同时实现逆转录反应和荧光探针的PCR 过程； 通过荧光拍照统计微滴群中发光微滴的比 例， 获得microRNA标记物miR ‑375‑3p和miR‑574‑ 3p的含量。 权利要求书3页 说明书5页 序列表2页 附图4页 CN 114703285 A 2022.07.05 CN 114703285 A 1.一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对前列腺癌外泌体 microRNA的检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 开发激光器可控输出模块： 激光器可控输出模块包括近红外光激光器(1)、 电压线性放大器(2)、 Arduino电路板 (3)、 Arduino  IDE开源平台； 所述近红外光激光器(1)具有I/O接口， 近红外光激光器(1)内 部具有一号开关电源(4)和二号开关电源(5)， 近红外光激光器(1)外部具有激光光纤探头 (6)； 所述近红外光激光器(1)通过I/O接口与电压线性放大器(2)、 Arduino电路板(3)相接 通； S2、 制备可相变光热响应性 微球： 将高效光热纳米材料与纳米颗粒通过多巴胺粘合在一起， 然后通过改进的 反应 在外部包裹SiO2外涂层， 形成光热复合材料； 将光热复合材料混入温敏性水凝胶， 形成复合 水凝胶； 最后通过微 流控微滴形成芯片， 将复合水凝胶乳化成微 滴群； 所述复合水凝胶还包含茎环形式逆转录引物、 特异性PCR引物以及taqman特异性荧光 探针； S3、 光推动的可相变微 滴数字PCR检测前列腺癌外泌体microRNA标记 物： 利用正交测试， 定量考量微滴群的升温速率受激光照射功率和纳米材料含量的影响， 在Arduino  IDE开源平台编译程序以优化光照程序， 并烧录进Arduino电路板(3)； 将微滴群 置于激光光纤探头(6)下方， 同时实现逆转录反应和荧光探针的PCR过程； 最后通过荧光拍 照统计微滴群中发光微滴的比例， 定量获得microRNA标记物miR ‑375‑3p和miR‑574‑3p的含 量。 2.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S1中， 所述Arduino电路板(3)的高 电平引脚和接地引脚分别与电压线性放大器 (2)控制端的输入电压正负极Vin+和Vin ‑相连； Arduino电路板(3)的供电和程序烧录通过 USB接口与电脑交 互。 3.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S1中， 所述电压线性放大器(2)由一号开关电源(4)供电， 电压线性放大器(2)的输 出电压正极与近红外光激光器(1)的 “外控模式功率调节 ”端口相连。 4.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S1中， 电压线性放大器(2)选用最终放大空间在0 ‑10W、 0‑20W， 0‑30W、 0‑50W、 0‑ 100W中的一种； 一号开关电源(4)和二号开关电源(5)均选用参数为12V ‑1A、 24V‑1A、 36V‑ 1A、 12V‑2A、 36V‑2A中的一种。 5.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 所述纳米颗粒为磁性F e3O4或SiO2， 其粒径为15 0～800nm。 6.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于，权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114703285 A 2步骤S2中， 所述 光热纳米材 料为MXene、 氧化石墨烯、 MoS2、 黑鳞中的一种。 7.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 所述温敏性水凝胶为琼脂糖水凝胶或在55 ‑95℃温度范围内为溶胶态， 温度 小于55℃时为凝胶态的小分子明胶。 8.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 采用flow ‑focusing结构的微流控通道乳化微滴， 交汇处水相通道宽度为30 μm、 50 μm、 75 μm、 100 μm中的一种； 交汇处油相通道宽度为30 μm、 50 μm、 75 μm、 100 μm中的一种； 水相通道和油相通道的深度均为6 0 μm。 9.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 乳化微滴的油相流量 ‑水相流量包括但不限于80 ‑70 μL/min、 100 ‑70 μL/min、 150‑80 μL/min、 200‑100 μL/min、 300‑120 μL/mi n中的一种。 10.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 微 滴群中乳化 微滴的尺寸范围是80～3 00 μm。 11.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 微 滴群中乳化 微滴的数量大于10 000个。 12.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S3中， 荧光探针PCR温度循环对应的光照程序如下： 单次反应过程为先95℃恒温30 秒， 再55℃恒 温60秒， 最后69℃恒温60秒， 总计循环30～40 次， PCR退火温度为55℃； 该光照 程序应用anal ogWrite函数 赋值近红外光的功率强度， 且二 者为线性对应关系。 13.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S3中， 逆转录反应对应的光照程序如 下： 先25℃恒温5分钟， 再50℃恒温15分钟， 最 后85℃恒温5分钟。 14.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S3中， 所述待检测的标记物miR ‑375‑3p的序列为UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA， 茎环 形式逆转录引物的序列为 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACTCACGC， 特异 性PCR引物： F： CTCGCGTGAGTCGTAT； R： GTCGTATC CAGTGCAG。 15.根据权利要求1所述的一种基于可控近红外光介导的相变溶胶微滴数字PCR技术对 前列腺癌外泌体microRNA的检测方法， 其特 征在于， 步骤S3中， 所述待检测的标记物miR ‑574‑3p的序列为CACGCUCAUGCACACACCCACA， 茎环 形式逆转录引物的序列为 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACTGTGGG， 特异 性PCR引物： F： ACAC CCACAGTCGTAT； R： GTCGTATC CAGTGCAG。权　利　要　求　书 2/3