(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210502574.3 (22)申请日 2022.05.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114592011 A (43)申请公布日 2022.06.07 (73)专利权人 广东药康生物科技有限公司 地址 528225 广东省佛山市南海区狮山 镇 321国道仙溪段广东生物医药产业基 地一期第一组团D栋二层、 三层 (72)发明人 李颖　王韬　王宏宇　蒋余亭　 陈景曦　黎晓雯　郑桂纯　 (74)专利代理 机构 北京天盾知识产权代理有限 公司 11421 专利代理师 丁敬博 (51)Int.Cl. C12N 15/89(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 9/22(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/54(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (56)对比文件 CN 109266680 A,2019.01.25 CN 111961685 A,2020.1 1.20 CN 112980846 A,2021.0 6.18 CN 111206054 A,2020.0 5.29 WO 2015066768 A1,2015.0 5.14 US 2007186301 A1,20 07.08.09 WO 2006105602 A1,20 06.10.12 Skarnes,W.C.et al.AC CESSION NO.JN9486 59,Mus musculus targeted KO- first, co nditional ready, lacZ-ta gged mutant al lele Ptds s2:tm1a(EUCOM M)Hmgu transgen ic. 《GenBan k》 .2011,FEATURES, ORIGIN. 无.ACCESSION NO.NM _013782， Mus musculus phosphatidylseri ne synthase 2 （Ptdss2） ， mRNA. 《GenBan k》 .2021,FEAT URES, ORIGIN. (续) 审查员 陈永强 (54)发明名称 一种PTDSS2条件性基因敲除小鼠模型的构 建方法 (57)摘要 本发明涉及一种使用CRISPR/Cas9技术构建 PTDSS2基因条件性敲除小鼠模型的方法， 其包 括： 1、 设计针对鼠源PTDSS2基因Exon2 ‑Exon3的 sgRNA， 2、 利用体外转录技术获得上述sgRNA， 3、 将打靶载体、 上述 sgRNA、 Cas9蛋白共注射或共电 转至小鼠受精卵等步骤。 与传统ES打靶小鼠模型 相比， 本发明首次构建的PTDSS2 基因条件 性敲除 小鼠模型具有高效、 快捷、 简便、 成本便宜等特 点， 且可以通过Cre来调控基因在特定的组织或 特定时间进行表达 。 [转续页] 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114592011 B 2022.08.05 CN 114592011 B (56)对比文件 William C. Skarnes et al.A conditional knockout resource for the genome–wide study of mouse gene functi on. 《Nature》 .201 1,第337-342页. 徐铭 等.利用CRIS PR/Cas9技术将LoxP序列靶向引入 小鼠Alk1基因. 《中国临床神经 科学》 .2015,第23卷(第0 6期),第615 -623页. Martin O Bergo et al.Defi ning the importance of phosphatidylseri ne synthase 2 in mice. 《TH E JOURNAL OF BIOLO GICAL CHEMISTRY》 .20 02,第277卷(第49期),第47 701- 47707页 摘要， 试验步骤， 结果部分.2/2 页 2[接上页] CN 114592011 B1.一种PTD SS2基因条件性 敲除小鼠模型构建方法， 其特 征在于， 该 方法包括如下步骤： （1） 设计 针对鼠源PTD SS2基因Exo n2‑Exon3的sgRNA； （2） 利用体外转录技 术获得上述sgRNA； （3） 将打靶载体、 步骤 （2） 获得的sgRNA、 Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质 或细胞核中， 并将该 受精卵移 植至假孕小鼠， 对假孕生仔鼠进 行基因型鉴定， 筛选成功插入 正确人源片段的阳性F0小鼠； （4） F0小鼠与背景鼠配繁获得F1小鼠， 对F1代鼠尾进行基因鉴定， 筛选出PTDSS2基因条 件性敲除小鼠模型； 所述步骤 （1） 中两端sgRNA识别位点分别位于小鼠PTDSS2基因的第二个外显子之前和 第三个外 显子之后； 所述步骤 （1） 中sgRNA的基因序列为SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2。 2.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中以sgRNA ‑F、 sgRNA‑R为引物对， puc57 ‑sgRNA质粒为模板进行PCR， PCR产物纯化制备sgRNA转录模板， 并 经过体外转录得到sgRNA； 所述步骤 （2） 中的引物对如SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6， 以及SEQ  ID NO.7和SEQ  ID  NO.8所示。 3.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中F0小鼠基因 型鉴定使用的5 ’端鉴定引物如SEQ  ID NO.13和SEQ  ID NO.14所示， 3 ’端鉴定引物如SEQ  ID  NO.15和SEQ  ID NO.16所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592011 B 3