(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210504089.X (22)申请日 2022.05.10 (71)申请人 赣南师范大学 地址 341000 江西省赣州市经济技 术开发 区师院南路1号赣南师 范大学 (72)发明人 余海中　张金波　方瑜婕　段硕　 陈玮　卢占军　胡威　朱博　 姚锋先　黄爱军　苏华楠　彭婷　 袁小勇　汪和贵　欧阳智刚 　 舒佳旺　刘佳阳　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 高辉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种获得CLas侵染柑橘木虱虫体的方法 (57)摘要 本发明提供了一种获得CLas侵染柑橘木虱 虫体的方法， 涉及昆虫生理生物化学技术领域。 本发明首先从不同浓度的霍格兰营养液中筛选 出最适合离体柑橘嫩枝存活的浓度； 利用常规 PCR以及实时荧光定量PCR技术选取感染黄龙病 菌的柑橘嫩枝并离体培养； 挑取柑橘木虱成虫、 4‑5龄若虫、 3龄及以下若虫筛选最适获菌虫期， 最终利用构建好的体系， 获得感染黄龙病菌的柑 橘木虱虫体， 为之后的理论研究提供基础材 料。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114717335 A 2022.07.08 CN 114717335 A 1.一种获得CLas侵染柑橘木虱虫体的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 筛选感病 枝条 并进行离体培养， 使用实时荧光定量PCR筛选Ct值相近的感病枝条， 将柑橘木虱放置于上述 感病枝条感染， 获得感病木虱虫体。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 使用PCR检测筛 选获得感病枝条。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR检测扩增引物为： F： 5’GCGCGTATGCA ATACGAGCG GCA 3’ R： 5’GCGTCGCGACT TCGCAACCCAT 3’。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述PCR检测反应程序为： 95℃预变性 3min； 95℃30s， 62℃3 0s， 72℃1mi n 10s， 34个 循环； 72℃5mi n； 25℃5mi n。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述离体培养的条件为使用0.1倍浓度～2 倍浓度霍格兰营养液培 养。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述实时荧 光定量PCR扩增引物为： F： 5’TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA 3’ R： 5’CCAACGAAAAGATCAGATAT TCCTCTA 3’。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR反应体系为： ddH2O  3.5 μL； SYBR  5 μL； F/R 0.25 μL； cDNA模板1 μL； 总体系10 μL。 8.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR反应程序为： 95℃预 变性1min； 95℃15s， 59℃15s， 72℃45s， 45个 循环。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述柑橘木虱的虫期为 4～5龄若虫。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述感染 天数为2～8天。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717335 A 2一种获得C Las侵染柑橘木 虱虫体的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及昆虫生理生物化学技术领域， 具体涉及一种获得CLas侵染柑橘木虱虫 体的方法。 背景技术 [0002]柑橘黄龙病(Huanglongbing， HLB)是世界柑橘产业中最具有毁灭性的病害之一。 由于目前对黄龙病感病树体尚无有效的治疗方法， 所以黄龙病 又称为柑橘的 “癌症”。 至今 黄龙病病菌(CLas)仍不能进行人工培养， 却能在柑橘木虱体内长期生长繁殖， 柑橘 木虱一 旦被黄龙病菌侵染就能够终身携带并迅速传播， 这给研究黄龙病及其防控 带来了巨大的困 难， 是近年来困扰柑橘产业的最大难题。 现今对柑橘黄龙病的防控主要聚焦在其传播虫媒 柑橘木虱上， 随着政府和果农的管理和防范， 野外柑橘木虱的存量相对较少， 感染黄龙病更 为稀有， 这就为以柑橘木虱为对 象开展其获菌实验以及相应的功 能研究带来了不少阻力。 因此， 在实验室内建立快速高效获得感染黄龙病菌的材 料的体系迫在眉睫。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一种快速获得感染黄龙病菌的柑橘木虱的方法， 直接利用 离体植物， 快速获得 大量感病材 料， 大大降低实验材 料成本。 [0004]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0005]本发明提供了一种获得CLas侵染柑橘木虱虫体的方法， 包括如下步骤： 筛选感病 枝条并进行离体培养， 使用实时荧光定量PCR筛选Ct值相近的感病枝条， 将柑橘木虱放置于 上述感病枝条感染， 获得感病木虱虫体。 [0006]本发明中， 使用PCR检测筛 选获得感病枝条。 [0007]本发明中， 所述PCR检测扩增引物为： [0008]F： 5’GCGCGTATGCA ATACGAGCG GCA 3’ [0009]R： 5’GCGTCGCGACT TCGCAACCCAT 3’。 [0010]本发明中， 所述PCR检测反应程序为： 95℃预变性3min； 95℃30s， 62℃30s， 72℃ 1min 10s， 34个 循环； 72℃5mi n； 25℃5mi n。 [0011]本发明中， 所述离体培 养的条件为使用0.1倍浓度～ 2倍浓度霍格兰营养液培 养。 [0012]本发明中， 所述实时荧 光定量PCR扩增引物为： [0013]F： 5’TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA 3’ [0014]R： 5’CCAACGAAAAGATCAGATAT TCCTCTA 3’。 [0015]本发明中， 所述实时荧光定量PCR反应体系为： ddH2O 3.5 μL； SYBR  5 μL； F/R 0.25 μ L； cDNA模板1 μL； 总体系10 μL。 [0016]本发明中， 所述实时荧光定量PCR反应程序为： 95℃预变性1min； 95℃15s， 59℃ 15s， 72℃45s， 45个 循环。 [0017]本发明中， 所述柑橘木虱的虫期为 4～5龄若虫。说　明　书 1/4 页 3 CN 114717335 A 3