(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210507407.8 (22)申请日 2022.05.10 (71)申请人 上海交通大 学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号 申请人 上海市内分泌代谢病研究所 (72)发明人 孙首悦　叶蕾　王文萃　 (74)专利代理 机构 上海泰能知识产权代理事务 所(普通合伙) 3123 3 专利代理师 黄志达 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂 盒 (57)摘要 本发明涉及一种靶向检测CAH候选基因的二 代测序试剂盒， 所述试剂盒包括： DNA提取试剂、 特异性扩增引物、 多重PCR引物、 多重PCR扩增试 剂。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114774549 A 2022.07.22 CN 114774549 A 1.一种靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： DNA提 取试剂、 特异性扩增引物、 多重PCR引物、 多重PCR扩增试剂。 2.一种如权利要求1所述靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂盒构建方法， 包括： (1)确定CAH候选基因， 具体为CYP21A2、 CYP17A1、 CYP11B1、 HSD3B2、 StAR、 CYP11A1、 POR、 H6PD、 CYP11B2； (2)设计C YP21A2基因PCR扩增引物， 进行 特异性扩增； (3)设计9个候选基因的多重PCR扩增引物； (4)进行CYP21A2多重PCR扩增； 其他8个候选基因进行多重PCR扩增， 然后将扩增产物混 合； (5)进行文库构建和扩增、 测序； (6)测序数据分析。 3.根据权利要求2所述方法， 其特 征在于， 所述 步骤(2)中PCR扩增引物为： CYP21A2‑F CGGACACTAT TGCCTGCACAGT TG； CYP21A2‑R GAATTAAGCCTCAATCCTCTGCAGCG。 4.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中CYP21A2多重PCR产物于与其 他8个候选基因的多重PCR产物混合比为1:5 0。 5.根据权利要求2所述方法， 其特征在于， 步骤(6)中修改比对基因组序列， 用N代替假 基因序列， 进行测序数据分析。 6.一种CAH基因诊断试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1所述二代测序试 剂盒联合多重连接依赖 探针扩增MLPA试剂盒。 7.根据权利要求6所述试剂盒， 其特征在于， 所述多重连接依赖探针扩增MLPA试剂盒用 于检测CYP21A2拷贝数变异。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774549 A 2一种靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因测序领域， 特别涉及一种靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂 盒。 背景技术 [0002]先天性肾上腺皮质 增生症(Congenital  adrenal hyperplasia,CAH)是一组常染 色体隐性遗传病， 属于性发育异常(disorders  of sex development,DSD)疾病的一类， 由 肾上腺皮质类固醇激素合成酶或辅因子的基因突变引起。 大约14种酶和辅因子参与肾上腺 类固醇生成。 随着十九世纪七八十年代， 基因克隆与扩增技术的问世， 有关人类疾病相关基 因定位研究蓬勃兴起。 1985年， Peterson等首次报道了由CYP21A2 基因突变导致的男性假两 性畸形。 1988年， Kagimoto等首次发表关于CYP17A1基因突变导致的17α ‑羟化酶/17， 20裂解 酶缺陷症的研究。 1991年， White等在摩洛哥血统的犹太人里发现了由CYP11B1基因 Arg448His突变导致的11β 羟化酶缺陷症。 随后， 由HSD3B 2、 StAR、 CYP11A1、 POR等基因突变导 致的CAH被先后报道 。 目前， 已报道包 括CYP21A2、 CYP17A1、 CYP11B1、 HSD3B 2、 StAR、 CYP11A1、 POR、 H6PD、 CYP11B2在内共9个基因的1000多种致病突变与CAH密切相关。 突变类型多样， 包 括编码区单核苷酸变异(Single  nucleotide  variation,SNV)、 小片段插入和缺失突变 (insertion  and deletion,Indel)、 剪接突变(Splicing)、 UTR区突变和大片段结构变异。 大多数患者是复合杂合子， 意味着在某个特定基因的两条等位基因上携带有不同的突变位 点。 通常患者的临床表现由酶活性保留更多、 功能更强的等位基因决定， 基因型和表型相关 性良好。 对于CAH患来说， 其每个子代均有50％的概率 成为无症状携带者。 根据经典型21OHD 的患病率1:10,000到1:20,000， 推算普通人群中杂合子的概率为1:50 ‑1:71。 基因检测不仅 有助于CAH的早期诊断、 明确 CAH亚型、 指导临床治疗， 而且可应用于产前诊断和遗传咨询， 降低后代罹患疾病的风险。 [0003]超过90％的先天性肾上腺皮质增生症患者 由CYP21A2双等位基因致病突变引起， 导致最常见的CAH亚型， 21α 羟化酶缺陷症(21α ‑hydroxylasedeficiency,21OHD)。 [0004]CYP21A2基因位于6号染色体(6p21.3)， 该区域易发生同源重组。 CYP21A2的假基因 (CYP21A1P)与其具有96 ‑98％的核苷酸序列同源性， 大约95％的CYP21A2致病突变由真假基 因同源重组导致， 包括65 ‑70％的点突变， 25 ‑30％的大片段基因缺失和重组， 另有5％由 CYP21A2基因自发突变引起。 发明内容 [0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向检测CAH候选基因的二代测序试剂 盒。 [0006]本发明建立了一个CAH基因检测方法， 包括一个同时检测CAH  9个候选基因二代测 序方法(CAH  panel)， 和多重连接依赖探针扩增(Multiplex  liga‑tion‑dependent  probe  amplification,MLPA)检测CYP21A2拷贝数变异， 基于此种方法对具有类CAH症状的患者进说　明　书 1/7 页 3 CN 114774549 A 3