(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210508916.2 (22)申请日 2022.05.10 (71)申请人 上海纳奥生物科技有限公司 地址 201900 上海市宝山区锦乐路947号2 幢102室 (72)发明人 亓立峰　 (74)专利代理 机构 杭州裕阳联合专利代理有限 公司 33289 专利代理师 盛影影 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、 应用 与试剂盒及样本处 理方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于早期肺癌无创筛查的 组合物、 应用与试剂盒及样 本处理方法， 包括： 特 异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂； 和特异性检测人SHP ‑1基因的DNA甲基化的检测 试剂。 本发明试剂盒检测CDH1基因和SHP ‑1基因 甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域， 还包 括基因的编码区域和非编码区， 这样进行多区域 检测有利于发现与早期肺癌高度相关的CDH1基 因和SHP‑1基因的靶序列， 同时也能够提高检测 的准确性及特异性， 提高CDH1基因和SHP ‑1基因 甲基化的检出率。 在分子水平上对于肺癌早期筛 查具有很强针对性， 具有检测特异性好、 灵敏度 高和可靠性佳等优点， 这样对于早期可能的肺癌 患者及早的进行 预防以及采取相应的治 疗措施。 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图1页 CN 115323053 A 2022.11.11 CN 115323053 A 1.一种用于早期肺癌无创筛查的组合物， 其特征在于， 所述的组合物包括： 特异性检测 人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂； 和特异性检测人SHP ‑1基因的DNA甲基化的检测试剂。 2.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物， 其特征在于， 所述的特异性 检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和 探针； 所述的特异性 检测人SHP ‑1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP ‑1基因的引物和探针。 3.根据权利要求2所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物， 其特征在于， 所述的特异性 检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示的引物以及 SEQ ID NO:3所示的探针； 所述的特异性检测人SHP ‑1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ  ID NO:4和SEQ  ID  NO:5所示的引物以及SEQ  ID NO:6所示的探针。 4.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物， 其特征在于， 所述组合物还 包括CDH1基因2个非 甲基化基因位点对应的探针， 序列为SEQ  ID NO:7； SHP ‑1基因2个非 甲 基化基因位 点对应的探针， 序列为SEQ  ID NO:8。 5.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的用于肺癌无创筛查的组合物在制备用于肺癌 早期 无创筛查、 疗效检测、 预后评估的试剂盒中的应用。 6.一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要 求1‑4所述的用于肺癌无创筛查的组合物。 7.根据权利要求6所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 所 述的试剂盒中还包括： 特异性检测内参基因的检测试剂； 所述的特异性检测内参基因的检 测试剂是针对人β ‑actin基因的引物和探针。 8.根据权利要求7所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂 盒， 其特征在于， 所 述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ  ID NO:9和SEQ  ID NO:10所示的 引物以及SEQ  ID NO:11所示的探针。 9.根据权利要求6 ‑8任一项所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒， 其特 征在于， 针对人CDH1基因的探针标记HEX荧光素， 针对人SHP ‑1基因的探针标记FAM荧光素， 针对人β‑actin基因的探针标记ROX荧 光素。 10.一种如权利要求6所述的用于肺癌筛查的甲基化检测试剂盒的样本处理方法， 其特 征在于， 所述样本处 理方法包括: (1)提供样本， 所述样本来源于健康人、 肺癌高危人群以及早期肺癌患 者的外周血或者 分离得到的血浆、 肺泡灌洗液、 或者痰液等样本； (2)对步骤(1)中样本进行DNA的提取， 进行DNA质量监控， 选取OD260/280在1.8～2.0之 间的DNA； (3)对步骤(2)中得到的游离DNA进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐重转化， 使DNA 中未发生甲基化的5 ’胞嘧啶转化为尿嘧啶， 而发生甲基化的5 ’胞嘧啶不发生改变， 最后得 到Bis‑DNA； (4)以步骤(3)中得到的Bis ‑DNA为模板， 使用权利要求1 ‑3中任一项所述的用于肺癌无 创筛查的组合物进行PCR扩增。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115323053 A 2一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、 应用与试剂盒及样本 处理方法 技术领域 [0001]本发明涉及肺癌早期筛查技术领域， 更具体地， 本发明涉及一种用于早期肺癌无 创筛查的组合物、 应用与试剂盒及样本处 理方法。 背景技术 [0002]肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。 肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤 中最高的， 但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤。 在当前的医疗体系下， 中晚期肺癌患者 五年 生存率仅为10 ‑20％， 但对于早期肺癌病人的治疗， 通过手术切除的方法约有80 ‑90％以上 可以治愈。 然而绝大多 数的早期肺癌患者没有明显的临床症状。 患者在初次诊断出肺癌时， 85％为中晚期， 早期诊断的比例仅约14％， 只有约16％的患者生存期能达到五年以上。 因此 肺癌早筛意 义重大， 有效的早期筛查和干预治疗可使肺癌的五年 生存期提高至80％以上。 [0003]目前对于肺癌早期筛查的方法有多种， 比如低剂量螺旋CT诊断、 组织细胞层面的 肺癌诊断、 基因层面的肺癌诊断等。 但这些技术手段存在 诸多弊端： 低 剂量CT检测存在较多 的假阳性； 组织层面的肺癌诊断在穿刺取样方面对患者具有创伤性， 且有可能导致癌细胞 扩散或转移； 基因层面的肿瘤特异性突变分子标志物检测 技术尚未成熟， 存在检测特异性 和准确度问题， 很多基因突变来自于健康人群中造血干细胞(Razavi， P.， et.al， Nature   Medicine， 2019， do i： 10.1038/s41591 ‑019)。 [0004]DNA甲基化作为一种新型分子标志， 在肿瘤诊断中的重要性日益 受到重视， 多个临 床实验结果表明， 肿瘤发生过程中某些特定基因的甲基化程度可作为肿瘤诊断的一种分子 标志， 并且这种改变是肿瘤所特有的。 DNA甲基化 发生在肿瘤的早期阶段， 并且稳定存在， 因 而能够在肿瘤形成初期利用PCR基因检测 手段提前发现， 为之后的预防、 治疗、 疾病监控以 及预后提供一个直观的潜在指标。 近来国内外研究发现血浆中一些基因的甲基化DNA的含 量水平用做早期诊断， 敏感性要好于已有的蛋白质血清标志物， 其中比较突出 的有与早期 肺癌相关的cyclin ‑dependent  kinase inhibitor  2A gene p16(p16)， SHOX ‑2， RASSF1A， CDH1等基因。 但是目前上市的肺癌甲基化检测试剂盒(SHOX ‑2， RASSF1A)由于检测灵敏度不 足仅局限于肿瘤组织水平以及肺泡灌洗液样本。 而通过患者血浆进行高灵敏和特异 性肺癌 早期检测与预后评估的标志 物还很缺乏。 发明内容 [0005]为了解决上述问题， 本发明提供了一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、 应用与 试剂盒及样本处理方法， 能够提高检测的准确 性及特异性， 在分子水平上对于肺癌早期筛 查具有很强针对性， 具有检测特异 性好、 灵敏度高和可靠性佳等优点， 这样对于早期可能的 肺癌患者及早的进行 预防以及采取相应的治疗措施。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0007]本发明提供一种用于早期肺癌无创筛查的组合物， 所述的组合物中包括： 特异性说　明　书 1/6 页 3 CN 115323053 A 3