(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210501485.7 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 北京丹大生物技 术有限公司 地址 101102 北京市北京经济技 术开发区 (通州)环科中路2号院19号楼1至3层 101 (72)发明人 周裕军　许秀丽　常缘荣　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 薛红凡 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备 方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测 用试剂及制备方法和应用， 属于分子生物检测技 术领域。 以聚乙烯吡咯烷酮K30作为冻干保护剂 与qPCR检测用试剂混合， 使制备的试剂 粉末达到 快速自然溶解的目的。 同时本发 明提供的试剂与 相同成分的液体试剂相比， 能够达到相似的检测 结果。 可见， 本发明提供的冻干 型荧光定量PCR检 测用试剂不仅自然复溶速度快， 而且检测结果不 受影响， 满足冻干型试剂 的要求， 此外还能大大 降低运输和保存的成分， 具有极大的市场竞争 力。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 114908192 A 2022.08.16 CN 114908192 A 1.一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂， 其特征在于， 是由以下反应体系经冷冻干燥后 得到， 所述反应体系为含质量百分含量4.5％～5.5％聚乙烯吡咯烷酮K30的qPCR检测用试 剂。 2.根据权利要求1所述试剂， 其特征在于， 所述qPCR检测用试剂为含8～12U/20μL化学 修饰Taq酶、 8～12U/20 μL  RNA酶抑制剂、 95～105mM  KAc、 1.8～2.2mM  MgAc、 体积百分浓度 0.09％～0.11％NP ‑40、 9～11mM硫酸铵、 5.5～6.5mM甜菜碱、 0.1～1mM  dNTP的72～78mM   Tris‑HCl缓冲液。 3.根据权利 要求2所述试剂， 其特征在于， 所述qPCR检测用试剂还含有2～4U/20 μL逆转 录酶。 4.根据权利要求1～3任意一项所述试剂， 其特征在于， 所述冷冻干燥的条件为在 ‑50℃ 冻干1～2h， 然后真空干燥3 h， 逐渐升温， 每升高10℃保持1h， 直到 升到25℃。 5.权利要求1～4任意一项所述试剂在制备疾病诊断或食品安全检测的试剂盒中的应 用。 6.根据权利要求5所述应用， 其特征在于， 所述疾病诊断包括人临床疾病诊断和/或动 物疾病检测。 7.一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1～4任意一项所 述试剂和检测用引物探针组。 8.根据权利要求7所述试剂盒， 其特征在于， 所述检测用引物包括冠状病毒N基因扩增 引物探针、 冠状病毒ORF基因扩增引物探针和内参基因扩增引物探针。 9.根据权利要求7所述试剂盒， 其特征在于， 所述病毒N基因扩增引物探针包括核苷酸 序列如SEQ  ID NO:1所示的正向引物、 核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示的反向引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO:3所示的探针； 所述ORF基因扩增引物探针包括如SEQ  ID NO:4所示的正向引物、 核苷酸序列如SEQ  ID  NO:5所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示的探针； 所述内参基因扩增引物探针包括如SEQ  ID NO:7所示的正向引物、 核苷酸序列如SEQ   ID NO:8所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示的探针。 10.权利要求7～ 9任意一项所述试剂盒在食品安全检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908192 A 2一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物检测技术领域， 具体涉及一种冻干型荧光定量PCR检测用试 剂及制备 方法和应用。 背景技术 [0002]实时荧光定量PCR(Quantitative  Real‑time PCR)是一种在DNA扩增反应中， 在 PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲 线对未知模板进 行定量分析的方法。 实时荧光定量P CR现已运用到临床疾病诊断、 动物疾病 检测、 食品安全检测等方面。 [0003]然而， 现有的荧光定量PC R检测用试剂， 大多为液体试剂， 运输时需要冷冻运输， 运 输成本极高。 除此之外， 液体试剂还需要冷冻保存， 需现配现用， 这样对实验人员的操作能 力有一定要求， 试剂使用时反复冻融对其稳定性也有一定影响。 而冻干型荧光定量P CR检测 用试剂不仅使运输更未方便， 而且运输和保存成本也大大降低， 相对于液体试剂具有明显 的优势。 然 而， 目前的冻干型 试剂存复溶时间长， 检测结果 不准确的问题。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方 法和应用， 具有快速自然复溶且检测结果 准确的特点。 [0005]本发明提供一种 冻干型荧 光定量PCR检测用试剂及制备 方法和应用 [0006]本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂， 是由以下反应体系经冷冻干 燥后得到， 所述反应体系为含质量百分含量4.5％～5.5％聚乙烯吡咯烷酮K30的qPCR检测 用试剂。 [0007]优选的， 所述qP CR检测用试剂为含8～12U/20 μL化学修饰Taq酶、 8～12U/20 μL  RNA 酶抑制剂、 95～105mM  KAc、 1.8～2.2mM  MgAc、 体积百分浓度0.09％～0.11％NP ‑40、 9～ 11mM硫酸铵、 5.5～6.5mM甜菜碱、 0.1～1mM  dNTP的72 ～78mM Tris‑HCl缓冲液。 [0008]优选的， 所述qPCR检测用试剂还 含有2～4U/20 μL逆转录酶。 [0009]优选的， 所述冷冻干燥的条件为在 ‑50℃冻干1～2h， 然后真空干燥3h， 逐渐升温， 每升高10℃保持1h， 直到 升到25℃。 [0010]本发明提供了所述试剂在制备疾病诊断或食品安全检测的试剂盒中的应用。 [0011]优选的， 所述疾病诊断包括人临床疾病诊断和/或动物疾病检测。 [0012]本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂盒， 包括所述试剂和检测用引 物探针组。 [0013]优选的， 所述检测用引物包括冠状病毒N基因扩增引物探针、 冠状病毒ORF基因扩 增引物探针和内参基因扩增引物探针。 [0014]优选的， 所述病毒N基因扩增引物探针包括核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示的正向 引物、 核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的探说　明　书 1/8 页 3 CN 114908192 A 3