(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210499001.X (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 福建佰孟医学 科技有限公司 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街 镇 福州大学科技园2号楼 201 (72)发明人 张荣才　 (74)专利代理 机构 福州科扬专利事务所(普通 合伙) 35001 专利代理师 魏珊珊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失 毒株双重荧 光PCR检测引物、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开一种非洲猪瘟病毒的野毒株与 CD2v基因缺失毒株双重荧光定量PCR检测引物， 针对p72基因的实时荧光PCR扩增引物如下所示： 上游引物p72 ‑F1： TGCGATGATGATTACCTTGC， 其为 SEQ ID NO .1序列 ； 下游引物p72 ‑R1 ： GATACCACAAGA TCAGCCGT， 其为SEQ  ID NO.2序列； 针对CD2v基因的实时荧光PCR扩增引物如下所 示 ： 上 游 引 物 C D 2 v ‑F 1 ： ATGAAGAAGAACAATGTCAGCA， 其为SEQ  ID NO.3序 列； 下游引物 CD2v‑R1： ACTGATAACGACTGTAAGGCT， 其为SEQ ID NO.4序列。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 115044706 A 2022.09.13 CN 115044706 A 1.一种非洲 猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测引物， 其特征在于， 针对p72基因的实时荧 光PCR扩增引物如下 所示： 上游引物p72 ‑F1： TGCGATGATGAT TACCTTGC， 其为SEQ ID NO.1序列； 下游引物p72 ‑R1： GATACCACAAGATCAGC CGT， 其为SEQ ID NO.2序列； 针对CD2v基因的实时荧 光PCR扩增引物如下 所示： 上游引物CD2v ‑F1： ATGAAGAAGAACAATGTCAGCA， 其 为SEQ ID NO.3序列； 下游引物CD2v ‑R1： ACTGATA ACGACTGTA AGGCT， 其为SEQ ID NO.4序列。 2.一种非洲 猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测探针， 其特征在于， 针对p72基因的荧 光探针p72 ‑P1， 如下所示： 探针p72‑P1： FAM‑TCTGGCCCTGCCCACCACGT ‑BHQ1， 其为SEQ  ID NO.5序列， FAM为荧光报 告基因， BHQ1为 荧光淬灭基因； 针对CD2v基因的荧 光探针CD2v ‑P1， 如下所示： 探针CD2v ‑P1： VIC‑TCCACTTCCATACATGAACCATCTCCAGA ‑BHQ1， 其为SEQ  ID NO.6序列， VIC为荧光报告基因， BHQ1为 荧光淬灭基因。 3.一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测试剂盒， 其特征在 于， 包括上述针对p72基因的扩增引物、 针对CD2v基因的扩增引物、 p72基因的探针p72 ‑P1， CD2v基因的探针CD2v ‑P1、 探针法荧 光定量检测试剂、 阳性对照和阴性对照。 4.如权利要求3所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检 测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒反应体系中上游引物p72 ‑F1、 下游引物p72 ‑R1、 上游引 物CD2v‑F1和下游引物CD2v ‑R1的浓度分别为0.1 ‑1 μM， 探针p72 ‑P1和探针CD2v ‑P1的浓度分 别为0.1‑1 μM。 5.一种非洲 猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检测方法， 其特征在于， 利用如权利要求3或4任一所述的试剂盒进行非洲猪瘟病毒检测， 区分野毒感染和含有CD2v 基因缺失的疫苗毒株。 6.如权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检 测方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： (1)样品处理： 当待检样品为猪血液、 脾脏、 淋巴结、 肾脏、 拭子等样品时， 可直接采用全 自动核酸 提取试剂盒或DNA提取 试剂盒提取DNA， 形成待检DNA备用； (2)反应体系配制： 将ASFV  Mix和酶系反应液瞬时离心后， 将ASFV  Mix反应液全部转移 到酶系管中， 震荡混匀或颠倒 混匀， 充分混匀后瞬时离心， 然后 分装到每个PCR反应管中各 15μL； 其中， ASFV  Mix试剂中包括p72基因的上下游引物、 CD2v基因的上下游引物、 荧光探 针、 buffer和过滤水； (3)分别取10 μL待检DNA、 10 μL阴性对照和10 μL阳性对照加入到不同的PCR反应管中， 加 样结束后盖紧PCR反应管， 震荡或颠倒 混匀之后瞬时离心， 每个PCR反应管内液体的体积为 25 μL阳性对照和阴性对照， 置 于室温下完全融解， 充分颠倒混匀后短暂离心； (4)PCR操作： 将瞬时离心好的PCR反应管放入荧光PCR检测仪内， 按照反应设置并做好 标记后进行检测； FAM通道和VIC通道下阳性对照应同时出现典型的扩增曲线且CT值均＜ 35， 且阴性对照无扩增曲线或无CT值出现， 则为有效检测； (5)结果判定 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044706 A 27.如权利要求6所述的一种非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v基因缺失毒株双重荧光PCR检 测方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中反应设置如下： 第一阶段， 95℃预变性3分钟； 第二阶 段， 95℃变性10秒， 60℃延伸30秒， 共45个循环； 荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸 时进行； p72基因选择 FAM荧光检测通道， CD2v基因选择VIC荧 光检测通道。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044706 A 3