(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210503012.0 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 河南牧业经济学院 地址 450000 河南省郑州市金 水区北林路 16号 （北林 校区） (72)发明人 乔宏兴　张菡　丁勇　孙彦婷　 边传周　张晓静　康宇　赵俊强　 (74)专利代理 机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 专利代理师 郭佳效 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、 引 物、 试剂盒及其方法 (57)摘要 本发明涉及一种检测绿色气球菌的特异分 子靶标、 引物、 试剂盒及其方法， 属于PCR检测技 术领域。 该特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 1所示。 本发明还提供了一种检测绿色气球菌 的特异分子靶 标的引物， 正向引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO： 2所示， 反向引 物的核苷酸序列如 SEQ ID NO： 3所示。 采用本发明的引物针对待测 样本进行PCR扩增， 通过检测扩增产物是否含有 目的条带， 判定样本中是否含有绿色气球菌， 具 有灵敏性高， 特异性强等优点， 可以满足快速、 特 异性检测鸭源绿 色气球菌的需求。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114959079 A 2022.08.30 CN 114959079 A 1.一种检测绿色气球菌的特异分子靶标， 其特征在于， 所述特异分子靶标的核苷酸序 列如SEQ ID NO： 1所示。 2.一种检测如权利要求1所述绿色气球菌的特异分子靶标的引物， 其特征在于， 正向引 物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 3.一种检测绿色气球菌的试剂盒， 其特 征在于， 包括如权利要求2所述的引物。 4.根据权利要求3所述的检测绿色气球菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 ddH2O、 2×Es Taq Master Mix。 5.一种检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提取待测样本的DNA， 用如 权利要求2所述的引物对 所述DNA进行扩增， 得到扩增产 物， 对扩增产 物进行电泳分析， 确定 是否存在绿色气球菌的特异性条带； 如存在所述特异性条带， 表明待测样本中含有绿色气 球菌， 否则， 表明待测样本中无绿色气球菌 。 6.根据权利要求5所述的检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 所述扩增的反应体系 包 括7 μL的ddH2O、 10 μL的2 ×Es Taq Master Mix、 0.5 μL的所述正向引物、 0.5 μL的所述反向引 物和2 μL的模板DNA； 所述 正向引物和反向引物的浓度均为10 μmo l/L。 7.根据权利要求6所述的检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 所述扩增的反应条件 为： 95℃预变性10min； 95℃变性30s， 50 ‑60℃退火30s， 72℃延伸30s， 变性、 退火、 延伸共计 重复30个循环； 72℃终延伸10mi n。 8.根据权利要求7所述的检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 所述退火的温度为57 ℃。 9.根据权利要求5 ‑8任一项所述的检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 所述绿色气球 菌的来源为畜牧业动物。 10.根据权利要求9所述的检测绿色气球菌的方法， 其特征在于， 所述畜牧业动物为鸭、 猪、 鸡、 羊、 鼠、 牛、 虾、 蟹中的一种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959079 A 2一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、 引物、 试剂盒及其方 法 技术领域 [0001]本发明属于PCR检测技术领域， 具体涉及一种检测绿色气球菌的特异分子靶标、 引 物、 试剂盒及其方法。 背景技术 [0002]绿色气球菌是一种人畜共患条件性致病菌， 在机体免疫力低下或免疫功能不健全 时， 可导致人发生败血症、 菌血症、 心 内膜炎、 尿道感染、 脑膜炎以及关节炎等。 但随着技术 的发展， 目前该病菌已在 多种经济动物和养殖动物上发现， 如猪、 羊、 牛、 鼠、 罗非鱼及虾蟹。 现有的研究表明， 绿色气球菌对幼畜的危害严重， 对成年家畜及水产领域也有一定危害。 绿 色气球菌引起的猪关节炎、 牛乳房炎等， 在畜牧业和养殖业造成了巨大的经济损失。 [0003]目前常规的细菌分离培养、 形态学观察和生理生化检验方法较为费时繁琐， 且极 易造成污染， 检测结果需要一周左右。 随着分子生物学的发展， PCR方法已成为快速检测病 原体的有效手段， 通过对待测菌的基因进行检测定性分析是否存在目的菌。 目前该项技术 已经广泛应用于畜牧业中， 可以更有效、 快速鉴定病原菌， 为临床诊断提供极大的助力。 然 而， 据国内外文献报道， 现有技 术目前还未建立绿色气球菌的特异性PCR检测方法。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种检测绿色气球菌的特异分子靶标， 利用该特异分子靶 标设计的引物对待测样本的DNA进行PCR扩增， 再检测扩增产物是否含有特异性条带， 判定 样本中是否含有绿色气球菌， 从而实现对绿色气球菌的特异性 鉴定。 [0005]本发明的第二个目的在于提供一种检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物。 [0006]本发明的第三个目的在于提供一种检测绿色气球菌的试剂盒。 [0007]本发明的第四个目的在于提供一种检测绿色气球菌的方法。 [0008]为了实现上述目的， 本发明所采用的技 术方案为： [0009]一种检测绿色气球菌的特异分子靶标， 所述特异分子靶标的核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 1所示。 [0010]本发明旨在识别该细 菌基因组DNA序列中具有PC R扩增特异性的模板序列， 通过截 取kemr序列， 使用bwa比对到CARD、 VAFD和8株绿色气球菌， 并使用samtools过滤掉比对到 CARD和VAFD的序列和未比对到绿色气球菌的序列， 将所有的KMER序列通过BLAST比对到 NCBI NT数据库， 统计并分析比对结果， 筛选绿色气球菌种的特异性序列， 对筛选的特异性 序列作为PCR鉴定的模板序列。 采用BLAST  primer对引物进行在线比对， 其准确性、 特异性 较好， 无其 他细菌非特异性扩增， 实现了绿色气球菌PCR鉴定 。 [0011]本发明的检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物采用的技 术方案为： [0012]一种检测绿色气球菌的特异分子靶标的引物， 正向引物AU ‑F的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 2所示， 反向引物 AU‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 [0013]本发明的引物是通过全基因组比较分析后获得， 具体是将上述筛选的绿色气球菌说　明　书 1/4 页 3 CN 114959079 A 3