(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210532107.5 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 山东和康源生物育种股份有限公司 地址 250101 山东省济南市高新区港兴三 路北段济南药谷研发平台1号楼B座 2101-212 2室 申请人 宁阳正和生物育种有限公司 　 山东宁阳和樱种鸭有限公司 (72)发明人 张中波　王胜　褚新星　汪建华　 许明清　 (74)专利代理 机构 北京科家知识产权代理事务 所(普通合伙) 11427 专利代理师 周瑜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A61B 5/15(2006.01) A61B 5/153(2006.01) A61B 10/00(2006.01) C12R 1/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采 集及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种一日龄种鸭常见垂传播 病原的病料采集及检测方法， 属于禽病学分子学 诊断技术领域， 该一种一日龄种鸭常见垂传播病 原的病料采集及检测方法， 步骤一、 雏鸭的颈上 部紧靠头的位置采集血氧待用， 解剖一日龄种 鸭， 获取内脏和组织， 泄殖腔棉拭子采样， 步骤 二、 首先利用内脏和组织对沙门氏菌、 鸭疫里默 氏杆菌进行分离鉴定， 同时检测垂直传播病毒。 病料采集方法包括： 采集血液、 卵黄囊、 肝脏、 泄 殖腔棉拭子等， 对种鸭垂传病原的样品采集， 通 过对采集的样品进行PCR检测， 可检测雏鸭是否 感染常见垂直传播病原， 本发明简单方便、 特异 性强， 通过对雏鸭的常见垂直传播病原的检测， 有利于种鸭早期的疾病防控和净化。 权利要求书3页 说明书9页 序列表3页 附图3页 CN 114891857 A 2022.08.12 CN 114891857 A 1.一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1、 雏鸭的颈上部紧靠头的位置采集血氧待用， 解剖一日龄种鸭， 获取内脏和组织， 泄 殖腔棉拭子采样； S2、 首先利用内脏和组织对沙门氏菌、 鸭疫里默氏杆菌进行分离鉴定， 同时检测垂直传 播病毒； S3、 待检雏鸭用消毒液将羽毛打湿， 置于剖检台， 点燃酒精灯， 打开腹腔， 灼烧吊菌环， 无菌采集 肝脏、 脑组织， 5％血清琼脂 培养基划线分离； S4、 采集的组织样品进行研磨处理后， 对禽流感病毒、 呼肠孤病毒、 鸭坦布苏病毒、 新型 鸭细小病毒、 鸭肝炎病毒的进行检测， 取离心后的上清液提取病毒RNA或DNA， RNA反转录为 cDNA后进行PCR扩增， DNA进行PCR扩增可以得到相应病毒的目的片段， 随后测序， 确定是否 感染病毒。 2.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S1中的操作步骤， 所述采好的血样要竖立放置， 避免受冷和振 动， 在25‑37℃环境中静置10 ‑30min， 这样有利于血液凝固和析出血清， 否则容易发生溶血， 然后放置4℃冰箱不少于4小时， 待纤维蛋白收缩后， 将血液以3000r/min离心10分钟， 取血 清作为待检样品。 3.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S1中的操作步骤， 所述雏鸭体表进行消毒， 从腹部剪开羽毛皮 肤， 打开腹腔漏出内脏， 采集脏器主要有肝脏、 脾脏、 肾脏、 肺脏、 胰腺、 脑等组织脏器， 未吸 收完全的卵黄单独摘除， 防止破裂撒体腔内， 在样品采集选择上， 最好多选取几只病料进 行 集中混合， 防止个体选择上造成漏检， 同时根据重点疫病特点， 选取针对性病毒含量高的部 位进行采集， 所采集的组织脏器不宜过大， 一般采集2 ×2cm大小的组织即可， 较小的脏器可 以全部取 出。 4.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S1中的操作步骤， 所述通过泄殖腔拭子采样的步骤包括： 将无 菌拭子用无菌生理盐水湿润后， 插入雏鸭泄殖腔内， 转动3 ‑5圈， 投入无菌离心管中， 折断拭 杆， 使其完全置 于管中， 盖紧管盖 。 5.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S2中的操作步骤， 所述肝脏、 卵黄取样， 无菌镊子取少量肝脏进 入增菌液， 取上述增菌液分区划线接种于 ss培养基上， 进 行菌落培养， SS 培养基出现紫色菌 落， 即可判定含有沙门氏菌 。 6.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S3中的操作步骤， 所述无菌采集肝脏、 脑组织， 5％血清琼脂培 养基划线分离， 5％血清营养培养基平板上生长出均匀一致的菌落， 表面光滑， 呈水滴状， 稍 隆起， 圆形， 边缘整齐， 45度角对光观察可见淡蓝 色荧光， 血清型鉴定： 将纯化后的鸭疫 里默 氏杆菌用无菌PBS吹下， 吹下来的菌落呈乳白色， 分别取25 μL菌液与1、 2、 6、 7、 10型等阳性血 清混合， 对应血清型在玻片上 出现颗粒状凝集。 7.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114891857 A 2征在于， 包括以下步骤： 根据S4中的操作步骤， 所述鸭呼肠孤病毒的检测方法包括： 采集的 组织样品进行研磨处理后， 取离心后的上清液提取病毒RNA， 并反转录为cDNA后进行PCR扩 增， 扩增引物为： XREO‑P1:ACCTCAGGATATCGCTGA AACT； XREO‑P2:CTCCATCCCTGCAGCACATGTA AAG； 目的片段为580bp， 扩增程序为50℃30min， 94℃5min， 95℃30s， 54℃30s， 72℃80s， 72℃ 8min； 结果判定： 鸭呼肠孤病毒RT ‑PCR扩增可以得到相对应目的条带大小 的片段， 则判定相 应的病料为阳性。 8.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S4中的操作步骤， 所述鸭坦布苏病毒的检测方法包括： 采集的 组织样品进行研磨处理后， 取离心后的上清液提取病毒RNA， 并反转录为cDNA后进行PCR扩 增， 扩增引物为： CAP3:ATGTCTA ACAAAAAACCAGG； CAP4:CAGC CCAGCAACTATCG； 目的片段为363bp， 扩增程序为50℃30min， 94℃5min， 95℃30s， 54℃30s， 72℃80s， 72℃ 5min； 结果判定： 坦布苏病毒RT ‑PCR扩增可以得到363bp 大小的片段， 并经测序得知属于鸭坦 布苏病毒， 则判定相应的病料为鸭坦布苏 阳性。 9.据权利要求1所述的一种一日龄种 鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S4中的操作步骤， 所述新型鸭细小病毒的检测方法包括： 采集 的组织样品进行研磨处理后， 取离心后的上清液提取病毒DNA， 进进行PCR扩增， 扩增引物 为： MZJ－细小s： GTG GTCGCAGGTCCGTAGA； MZJ－细小x:C CAACAGAGCAGCA AAGA； 目的片段为3 63bp， 扩增程序为94℃3mi n， 95℃15s， 54℃15s， 72℃80s， 72℃5mi n； 结果判定： 新型鸭细小病毒PCR扩增可以得到363bp目的片段， 并经测序分析后属于新 型鸭细小病毒， 则判定相应的病料为阳性。 10.据权利要求1所述的一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 根据S4中的操作步骤， 所述病毒的检测方法包括： 采集的组织样品 进行研磨处理后， 取离心后的上清液提取病毒RNA， 并反转录为cDNA后进行PCR扩增， 扩增引 物为： 鸭肝炎病毒引物序列： DH1‑3： GACTGTGCA ACACGCTTCAAC； DH1‑4： AATCTACTTCATCCCCAGACTG； 目的片段为473bp， 扩增程序为51℃30min， 94℃5min， 95℃15s， 54℃30s， 72℃80s， 72℃ 10min； DH3‑3： TGTGTATCT TATGAGCAG GCCA； DH3‑4： AGCCCAACACGGCAAGCAC；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114891857 A 3