(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210500439.5 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 山东省食品药品检验研究院 地址 250101 山东省济南市高新区新 泺大 街2749号 (72)发明人 解盈盈　林永强　汪冰　郭东晓　 薛菲　崔伟亮　栾永福　周广涛　 (74)专利代理 机构 北京元本知识产权代理事务 所(普通合伙) 11308 专利代理师 徐苹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山 银花及其制剂的方法 (57)摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 尤其涉及 一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花 及其制剂的方法。 所述特异性引物包括上游引物 和下游引物， 上游引物的核苷酸序列为5 ' ‑ TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA ‑3'， 下游引物的核 苷酸序列为5' ‑GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA ‑3； T a q M a n 探 针 的 核 苷 酸 序 列 为 5 'F A M ‑ TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA ‑BQ13'。 TaqMan探 针法是首次应用到山银花的鉴别； 专属性强， 从 物种DNA层面鉴别山银花， 本发明所述引物及探 针序列是山银花所专有， 其他物种或药材则无此 序列； 灵敏度高， 只要ng级别的模板DNA浓度， 当 药材、 饮片及制剂中掺入1％的山银花药材或粉 末即可检出； 适用性广， 不受药材生长环境及外 观性状的影 响， 性状完全破碎的药材粉末均可应 用， 对于山银花制剂中可检查山银花原料药材基 源是否正确， 即使经过加工炮制的山银花制剂也适用。 权利要求书1页 说明书13页 序列表1页 附图5页 CN 114807419 A 2022.07.29 CN 114807419 A 1.一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法， 其特征在于， 所述 特 异性 引物包括上游 引物 和下游 引物 ， 所述上游 引物的 核苷酸 序列为5 ' ‑ TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA ‑3 '， 所述下游引物的核苷酸序列为5 ' ‑ GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA ‑3； 所述TaqMan探针5'端标记荧光素基团FAM， 3'端标记淬灭 基团BHQ1， 所述TaqMan探针的核苷酸序列为5'FAM ‑TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA‑BQ13'。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 结合所述TaqMan探针和特异性引物进行实时荧光PCR反应， 检测或辅助检测待测样品 中是否含有或候选含有山银花； 结合所述TaqMan探针和特异性引物进行实时荧光PCR反应， 检测或辅助检测待测样品 是否为或候选为 山银花。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述方法的主 要步骤包括： (1)提取待测样品的总DNA； (2)以提取的DNA为模板， 配制PCR反应体系， 所述PCR反应体系中包括权利1要求所述的 上游引物、 下游引物和TaqMan探针， 设置 反应条件， 将PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中进 行反应； (3)根据反应结果对山银花及其制剂进行 特异性鉴别。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的PCR反应体系为： 总体积 为20 μL时， 荧光PCR反应混合液(2 ×)10 μL、 权利要求1所述TaqM an探针(5 μmol/L)1μL、 权利 要求1所述上游引物(2 0 μmol/L)1 μL、 权利要求1所述下游引物(20 μmol/L)1 μL、 模板DNA溶液 2 μL、 灭菌超纯 水5 μL。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的反应条件为： 阶段1： 95 ℃， 3分钟； 阶段2： 95℃， 10秒， 58℃， 32秒， 40个 循环。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述根据反应结果对山银花及 其制剂进行 特异性鉴别， 包括： (1)无荧光对数增长， 视为未检出山银花； (2)有荧光对数增长， 且相应的CT值＞3 0.0， 视为未检出山银花； (3)有荧光对数增长， 且相应的CT值＜3 0.0， 视为检出山银花。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807419 A 2一种利用TaqMa n探针和特异性引物鉴别山 银花及其制剂的 方法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 涉及制剂及药材检验检测方法， 尤其涉及一种 利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。 背景技术 [0002]山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、 红腺忍冬、 华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾 或带初开的花， 根据查阅文献及市场调研发现目前市场上销售流通的山银花基原样品主要 为灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬， 其中以灰毡毛忍冬最为常见。 金银花为忍冬科植物忍冬的干 燥花蕾或带初开的花。 金银花与山银花均用于温病发热、 喉痹、 热毒 血痢、 风寒感冒等病症。 自2005年版 《中国药典》 将山银花列出作为单个药材后， 由于金银花价格昂贵， 市场上常有 用山银花假冒或混淆金银花的现象； 两者虽然在药理作用上有一定共性， 但在某些药理作 用上两者还是有一定差异， 如山银花中存在致敏反应的皂苷成分， 而金银花中皂苷则不发 生过敏反应。 因此为保证临床用药安全， 建立快速简便 灵敏度好的检测方法是十分必要的。 [0003]通过查阅文献， 目前鉴别山银花与金银花的主要方法为性状及液相色谱法， 性状 鉴别易受采收加工及炮制方法的影响， 同时性状鉴别对检验人员专业能力及水平要求较 高； 液相鉴别方法主要根据化学成分的差异进行鉴别， 山银花(灰毡毛忍冬)中含有灰毡毛 忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙， 金银花则不含这两种化学成分， 这种鉴别方法需要高效液相 色谱仪， 需要购买相应的对照品， 成本较高。 目前虽已有金银花与山银花的鉴别方法， 但该 方法检测灵敏度较低， 成本高， 对检验人员专业 技术水平要求较高， 不 适合广泛应用。 [0004]TaqMan探针法是实 时荧光PCR方法的一种， 该法是在原有实 时荧光PC R基础上引入 探针。 探针5 ’端标记荧光报告基团， 3 ’端标记荧光淬灭基团， 当探针引物特异性结合， DNA模 板开始扩增， 当Taq  DNA聚合酶碰到探针5 ’端荧光报告基团， 外切酶将5 ’端报告基团切割， 游离出来， 发出荧光信号。 该方法目前主要应用到食品领域， 对于药品领域则应用较少。 与 传统理化鉴别方法相比TaqMan探针法特异性好， 灵敏度高， 不仅可以鉴别药材及饮片， 还 可 以鉴别山银花制剂中原料 药材的真伪。 发明内容 [0005]为解决上述现有技术中存在的问题， 本 发明提供了一种利用TaqMan探针和特异性 引物鉴别山银花及其制剂的方法。 本发 明设计出山银花共同特有的特异 性引物及 TaqMan探 针， 这一特异引物和探针可以同时检查金银花药材及制剂 中有无掺加 山银花， 山银花药材 及饮片是否为正品基源山银花， 山银花制剂中是否投料山银花， 原料药基源是否正确。 该方 法灵敏度高， 特异 性好， 重复性好， 成本低， 对于检查金银花药材、 饮片及制剂中是否掺有山 银花， 及山银花制剂中是否投料山银花药 材或粉末具有较好 适用性。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法， 所述特异性引物说　明　书 1/13 页 3 CN 114807419 A 3