(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210502978.2 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 上海大格生物科技有限公司 地址 201499 上海市奉贤区环城东路123弄 1号5幢A区4层西侧 (72)发明人 邵巍　王鑫杰　郑海燕　李亚伟　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 专利代理师 陈艳娟　许亦琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6827(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 利用Crispr技术检测BRAF基因突变的试剂 盒及应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 公开了一种BRAF   V600E基因突变检测方法、 检测体系及试剂盒。 本 发明公开的用于BRAF  V600E突变的检测体系包 括切口酶， 靶向突变位点的引导RNA， 荧光报告系 统； 所述切口酶具有核酸内切酶活性。 本发明公 开了Crispr技术在BRAF  V600E突变检测中的新 应用。 本发 明的检测体系和检测试剂盒能够快捷 且可视化地对炎症、 自身免疫性疾病或肿瘤中存 在的BRAF  V600E突变进行检测， 具有高灵敏度、 高特异性的特点， 应用前 景广泛。 权利要求书3页 说明书13页 序列表5页 附图4页 CN 114959029 A 2022.08.30 CN 114959029 A 1.一种BRAF  V600E基因突变的检测体系， 其特征在于， 所述检测体系包括切口酶或其 编码基因， 靶向突变位点的引导RNA或其编码基因， 荧光报告系统； 所述切口酶具有核酸内 切酶活性。 2.如权利要求1所述的检测体系， 其特征在于， 所述切口酶和引导RNA形成复合体， 所述 复合体特异性结合含突变位点的靶向序列， 激活切口酶非特异性地切割荧光报告系统， 释 放出荧光基团； 和/或， 所述核酸选自DNA、 cDNA、 RNA、 siRNA、 反义寡核苷酸、 核酶、 适体核酸 类似物、 肽 ‑核酸嵌合体中的一种或其任意组合。 3.如权利要求1所述的检测体系， 其特 征在于， 包 含以下至少任一项： 1)所述切口酶为CRISPR/Cas效应蛋白或其变体； 优选地， 所述Cas蛋白选自Cas12、 Cas14家族蛋白或其变体的任意一种或几种组合； 更优选地， 所述Cas12家族蛋白选自 Cas12a、 Cas12i、 Cas12j、 Cas12b、 Cas12d、 Cas12e、 Cas12f、 Cas12g、 Cas12h中的一种或其任 意组合； 更优选地， 所述切口酶选自Cas12a或其变 体； 2)所述检测体系包含切口酶的表达载体以及适于表达切口酶的成分； 在检测体系中， 所述表达载体表达切口酶， 与引导RNA形成复合体， 进 而用于荧 光检测反应。 3)所述引导RNA包含crRNA； 优选地， 所述引导RNA为crRNA； 进一步优选地， 所述crRNA长 度为23bp， 其覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配； 进一步优选地， 所述crRNA包含一处或 几处错配碱基； 更进一 步优选地， 所述crRNA包 含一处错配碱基； 4)所述检测体系包含引导RNA的表达载体以及适于表达引导RNA的成分； 在检测体系 中， 所述表达载体表达引导RNA， 与所述切口酶形成复合体， 进 而用于荧 光检测反应。 5)所述荧光报告系统为在s sDNA两端分别标记荧 光示踪物和荧 光淬灭剂的报告系统。 4.如权利要求3所述的检测体系， 其特征在于， 所述荧光示踪物选自小分子荧光素、 荧 光蛋白或串联荧光染料； 荧光示踪物和荧光淬灭剂的配对原则为荧光示踪物的发射波长为 荧光淬灭剂的吸 收波长； 进一步优选地， 选自以下任一项： 1)所述荧光蛋白选自藻红蛋白、 藻蓝蛋白、 藻红蓝蛋白以及别藻蓝蛋白中的至少一种； 2)所述小分子荧光素选自FAM、 FITC、 Cy5、 Cy3、 Cy5.5、 Alexa  Flour系列荧光素、 Dylight系列荧光素、 Pacific  blue、 TRITC、 TA MRA以及罗丹明中的至少一种； 所述小分子荧 光素选自6 ‑羧基荧光素(6‑FAM)； 3)所述串联荧 光染料为链霉亲和素 ‑藻红蛋白(SAPE)； 4)所述荧光淬灭剂选自BHQ1、 DABCYL、 BHQ2、 QSY7、 QSY9、 QSY21、 QSY35、 ATTO540Q、 ATTO580Q、 AT TO612Q、 DYQ6 60和DYQ661中的至少一种。 5.如权利要求1所述的检测体系， 其特征在于， 所述检测体系还包括用于核酸突变位点 扩增的引物； 所述扩增优选为 等温扩增。 6.如权利要求1所述的检测体系， 其特 征在于， 包 含以下至少任一项： 1)所述切口酶为Cas12a； 所述Cas12a的识别的PAM序列为T TTN； 2)所述crRNA长度为23bp， 其覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配； 优选地， 所述crRNA 序列选自SEQ  ID NO.4、 5和7至少任一； 进一 步优选地， 所述crRNA序列如SEQ  ID NO.7所示； 3)所述荧光报告系统包含ssDNA， 所述ssDNA为TTTATTT， 其5 ’端以6FAM修饰， 3 ’端以 3BHQ1修饰；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114959029 A 24)所述扩增引物对序列分别如SEQ  ID NO.24和SEQ  ID NO.28所示。 7.如权利要求1～6任一项所述的检测体系， 其特 征在于， 包括以下至少任一项： 1)所述检测体系用于炎症、 自身免疫性疾病或肿瘤中存在的BRAF  V600E基因突变的检 测； 2)所述样本选自血液、 组织、 血细胞、 骨髓、 腹水、 细针活检样本、 含有细胞的体液、 游离 漂浮核酸、 痰液、 唾液、 尿液、 脑脊液腹膜液、 胸膜液、 粪便、 淋巴、 皮肤拭子、 口服拭子、 鼻拭 子或灌洗物中的至少一种； 优选地， 所述样本为血 液样本或组织样本 。 8.一种BRAF  V600E基因突变检测产品， 其特征在于， 所述检测产品包含如权利 要求1～ 7任一项所述的检测体系。 9.一种基于CRISPR/Cas12a 的BRAF V600E突变检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包含特异性检测BRAF  V600E突变型DNA的Cas12a荧光检测体系； 所述检测体系包含： Cas12a蛋白、 针对BRAF  V600E突变型的特异性crRNA、 高效等温扩增引物组合和ssDNA报告 系统； 所述crRNA序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述高效等温扩增引物组序列分别为SEQ  ID NO.24和SEQ  ID NO.28； 所述ssDNA报告系统包含ssDNA， 所述ssDNA为TTTATTT， 其5 ’端以6FAM修饰， 3 ’端以 3BHQ1修饰。 10.如权利要求1～7任一项所述的检测体系或如权利要求8或9所述的检测产品， 其特 征在于， 所述crRNA的制备可通过构建载体pUC57 ‑T7‑crRNA， 经体外转录获得； 或通过直接 合成获得。 11.如权利要求1～8之任一项所述的检测体系或如权利要求10～11任一项所述的检测 产品在制备用于检测疾病中BRAF  V600E基因突变的检测产品中的用途； 优选地， 所述疾病 选自炎症、 自身免疫性疾病或肿瘤中至少任一种。 12.切口酶和/或引导RNA 或包含两者的Crispr体系在制备疾病中BRAF  V600E基因突变 的检测产品中的用途； 所述切口酶、 crRNA分别如权利要求1～7所述的检测体系中所述； 优 选地， 所述疾病选自炎症、 自身免疫性疾病或肿瘤中至少任一种。 13.一种BRAF  V600E基因突变位 点的快速检测方法， 其特 征在于， 对于血液样本， 所述方法包括以下步骤： 步骤a： 利用红细胞裂解液处 理血液样本， 离心获得富 集的白细胞； 步骤b： 利用核酸快速释放剂释放白细胞中的核酸； 步骤c： 利用等温扩增技术扩增待测样本中的核酸： 将覆盖BRAF  V600E区域的特异性引 物组SEQ ID NO.24和SEQ  ID NO.28， 和步骤b获得的产物加入到RPA等温扩增体系中， 进行 扩增反应； 步骤d： 将步骤c的产物加入到如权利要求1～8任一项所述的检测体系中， 进行荧光检 测反应； 步骤e： 利用酶标仪读数或在荧 光灯下肉眼观察判读结果； 对于组织样本， 所述方法包括以下步骤： 步骤a： 取组织样本， 包括 新鲜组织和/或石蜡切片； 步骤b： 利用DNA快速提取 试剂处理样本， 获取基因 组DNA；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114959029 A 3