(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221049696 3.X (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 山西农业大 学 地址 030801 山西省晋中市太 谷区铭贤南 路1号 (72)发明人 王瑞云　丁敏　王计平　曹晓宁　 段政勇　王宇卓　薛亚鹏　王晓丹　 王海岗　陈凌　乔治军　刘国庆　 迪帕克　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种针对糜子GBS SI基因开发的功能标记 (57)摘要 本发明提供了一种针对糜子GBSSI基因开发 的功能标记， 涉及分子标记技术领域。 本发明提 供了一组用于糜子基因分型的SNP ‑CAPS分子标 记， 命名为RYW215和RYW216。 本发明还结合SNP ‑ CAPS分子 标记和InDel标记(RYW214)进行糜子直 链淀粉含量的鉴定和预测， 解决非特异性延伸问 题， 缩短目标片段长度， 配合增加胶浓度、 降低电 源电压方法将15bp的片段差异区分开来。 利用本 发明所述功能标记可鉴定糜子的粳糯性， 并判定 直链淀粉含量与基因型的关系， 从而为新品种的 选育提供检测工具。 权利要求书1页 说明书21页 序列表2页 附图3页 CN 114836564 A 2022.08.02 CN 114836564 A 1.一组用于糜子基因分型的SNP ‑CAPS分子标记， 其特征在于， 所述SNP ‑CAPS分子标记 包括RYW215和RYW216； 针对RYW215设计的引物对包括Int5Lf和R3， 所述Int5Lf的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1 所示， 所述R3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 针对RYW216设计的引物对包括M12和R12， 所述M12的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述R12的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述SNP ‑CAPS分子标记， 其特征在于， 所述Int5Lf和R3的扩增片段为 223bp， 当SNP位 点存在A替换G时， 扩增片段能被AC CI酶切产生171bp和52bp两个片段； 所述M12和R12的扩增片段为645bp， 当SNP位点存在插入A导致移码突变时， 扩增片段能 被EcoNI酶切产生3 59bp和286bp两个片段。 3.一种针对糜子GBSSI基因开发的功能标记， 其特征在于， 包括InDel分子标记和权利 要求1或2所述SNP ‑CAPS分子标记； 所述InDel分子标记包括RYW214， 针对 RYW214设计的2对嵌套引物包括： M5QT1和R11QT1 组成的引物对及M5QT2和R11QT2组成的引物对； 所述M5QT1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所 示， R11QT1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述M5QT2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所 示， 所述R 11QT2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 4.根据权利 要求3所述功能标记， 其特征在于， 还包括针对RYW2 14设计的常规引物对M5 和R11， 其中M5的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示， R 11的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示。 5.一种检测针对糜子GBSSI基因开发的功能标记的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 括针对权利要求3或4所述功能标记设计的引物。 6.权利要求1或2所述SNP ‑CAPS分子标记或权利 要求3或4所述功能标记或权利 要求5所 述试剂盒在预测糜子直链淀粉 含量中的应用。 7.权利要求1或2所述SNP ‑CAPS分子标记或权利 要求3或4所述功能标记或权利 要求5所 述试剂盒在区分糜子粳 糯表型中的应用。 8.权利要求1或2所述SNP ‑CAPS分子标记或权利 要求3或4所述功能标记或权利 要求5所 述试剂盒在培 育糜子新品种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836564 A 2一种针对糜子GBS SI基因开发的功能标记 技术领域 [0001]本发明属于分子标记技术领域， 具体涉及一种针对糜子GBSSI基因开发的功能标 记。 背景技术 [0002]糜子(Panicum  miliaceum  L.)是禾本科黍属作物， 异源四倍体， 具有耐旱、 耐瘠、 抗盐碱等优良特性。 由于其抗逆性 强、 生育期短， 广泛种植于干旱、 半干旱地区。 糜子起源于 中国黄河流域黄土高原， 种 植历史达10300年， 山西是糜子的起源中心。 近年来， 土壤干旱、 盐渍等问题日益突出， 基于糜子耐旱、 耐盐碱等特性建立系统鉴选体系为盐碱地修复提供 了重要资源， Yuan等[1‑2]从转录组和蛋白组层面揭示了糜子抗逆、 耐盐碱的生理机制。 糜子 又有粳糯糜子 之分， 糯糜子称为黍子， 籽粒脱壳产品为黄米， 因其口感软糯， 风味较好， 常用 来做枣糕、 油糕等食品； 粳性糜子籽粒脱壳后称糜米， 用来制作炒米。 依据颖果胚乳中直链 淀粉含量， 将直链淀粉 含量<3.7％的划归糯性糜子 。 [0003]粳糯性状主要由Waxy基因控制， Waxy基因又名蜡质基因， 在谷类作物中具有编码 直链淀粉合 成过程中的关键酶 ‑颗粒结合淀粉合 成酶(GBSS)的作用。 目前， 编码GBSS的基因 已在水稻、 小麦、 玉米、 薯类等多种作物中克隆。 禾谷类作物糯质性状多由Waxy基因变异导 致， 研究发现玉米Waxy基因包含14个外显子和13个内含子， 其糯质受到隐性Waxy基因控 制[3]。 徐春燕等[4]以玉米昌7 ‑2、 Mo17、 B73为试验材料， 克隆Waxy基因并测序， 对胚乳淀粉体 进行纯化结果发现， GBSSI蛋白第155位氨基酸的改变减弱了与淀粉的结合度； 并对第4外显 子的SNP位点和第7外显子的缺 失位点进行了分子标记 开发。 小麦Waxy基因启动子区和5 ’非 翻译区存在413bp的InDel序列， 该序列的缺失与基因表达相关[5]。 在水稻GBSS基因第一内 含子剪切位点上游55b p处存在一个(CT)n重复序列， 以92份美国水稻为材料， 分析了Waxy基 因相关SSR的多态 性与直链淀粉含量的关系， 检测了(CT)8到(CT)20等多个等位变异， 发现基 因型(CT)18品种直链淀粉含量最低[6‑7]。 Kawase等[8]研究发现糯性/低直链淀粉含量谷子起 源于东亚和东南亚， 由当地人喜好选择驯化而来。 Fukunaga等[9]通过Southern杂交， 依据谷 子Waxy基因插入序列的不同将其划分为7种类型(I～VII)， 其中III、 IV、 V和VII中插入序列 较大。 粳糯糜子胚乳中都含有Waxy编码蛋白， 只是相对于粳性植株而言， 糯性品种中缺乏 GBSSI活性。 早在2009年， Graybosch等[10]对糯性糜 子材料(陇糜16和陇糜18)的胚乳性质进 行研究发现， 糯性性状由2个隐性等位基因控制。 Hunt等[11]对糜子Waxy基因进行测 序发现， Waxy基因以L和S(GBSSI ‑L和GBSSI ‑S)两种形式存在， 在GBSSI ‑S基因外显子10附近存在 15bp的缺失(野生型为S0， 突变型为S‑15)， 该缺失与GBSSI失活效应间存在对应关系， 即与糯 性胚乳相对应； 在GBSSI ‑L基因上观察到2个多态性位点， 位于外显子9处的移码突变(腺嘌 呤残基的插入/缺失)， 以及位于外显子7处的SNP位点突变(A替换G)， 该基因不存在移码突 变和SNP位点突变的基因型LC。 2013年， Hunt等[12]利用I2‑KI显色反应， 发现S‑15/LC基因型的 糜子品种胚乳细胞淀粉粒外部被染成红色， 内部被染成蓝 色， 说明该基因型具有中间表型， LC等位基因可以催化合成直链淀粉蛋白， 因此， L和S等位基因对糜子胚乳结构均具有调控说　明　书 1/21 页 3 CN 114836564 A 3