(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221049715 0.2 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号院 (72)发明人 李林　韩婧婉　朱博　王晓蕊　 施玉婷　李韩平　刘永健　贾磊　 王晓林　李敬云　李天一　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 白艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 扩增HIV-1 pol- env部分片段鉴定重组毒株 的引物组合物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种扩增HIV ‑1pol‑env部分 片段鉴定HIV ‑1毒株的方法及其专用引物组合 物。 本发明提供的引物组合物， 由序列表的序列1 所示DNA、 序列表的序列2所示DNA所示DNA、 序列 表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组 成。 本发明可应用于HIV ‑1毒株重组热点区域 pol‑env部分片段序列(HXB2： 4800 ‑6400)的扩增 及鉴定、 HIV ‑1纯亚型毒株、 重组毒株及二代重组 毒株的鉴定和单一HIV ‑1pol区1.3kb短片段 (HXB2： 2253 ‑3550)HIV ‑1毒株鉴定分析所致的毒 株错误分型的纠正。 权利要求书4页 说明书18页 序列表6页 附图6页 CN 114934135 A 2022.08.23 CN 114934135 A 1.成套引物， 包括引物组1； 所述引物组1由引物1、 引物 2、 引物3和引物4组成； 所述引物1的核苷酸序列为序列表的序列1或将序列1至少一个经过一个或几个核苷酸 的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物2的核苷酸序列为序列表的序列2或将序列2至少一个经过一个或几个核苷酸 的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物3的核苷酸序列为序列表的序列3或将序列3至少一个经过一个或几个核苷酸 的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物4的核苷酸序列为序列表的序列4或将序列4至少一个经过一个或几个核苷酸 的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列。 2.根据权利要求1所述的成套引物， 其特 征在于： 所述成套引物还 包括引物组2； 所述引物组2由引物DR ‑1和引物DR ‑2与引物DR ‑3和引物DR ‑4组成； 所述引物DR ‑1的核苷酸序列为序列表的序列6或将序列6至少一个经过一个或几个核 苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物DR ‑2的核苷酸序列为序列表的序列7或将序列7至少一个经过一个或几个核 苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物DR ‑3的核苷酸序列为序列表的序列8或将序列8至少一个经过一个或几个核 苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列； 所述引物DR ‑4的核苷酸序列为序列表的序列9或将序列9至少一个经过一个或几个核 苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所 得的与原序列功能相同的序列。 3.用于鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒的成套PCR试剂， 包括PCR试剂1； 所述PCR试剂1包括PCR试剂1 ‑1和PCR试剂1 ‑2； 所述PCR试剂1 ‑1含有权利要求1中的引物1和引物 2； 所述PCR试剂1 ‑2含有权利要求1中的引物3和引物4； 各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4 μM 。 4.根据权利要求3所述的成套PCR试剂， 其特征在于： 所述成套PCR试剂还包括PCR试剂 2； 所述PCR试剂2包括PCR试剂2 ‑1和PCR试剂2 ‑2； 所述PCR试剂2 ‑1含有权利要求1中的引物DR ‑1和引物DR ‑2； 所述PCR试剂2 ‑2含有权利要求1中的引物DR ‑3和引物DR ‑4； 各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4 μM 。 5.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的成套PCR试剂在制备试剂盒中 的应用， 所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)： (a)扩增人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株po l‑env部分序列； (b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株或其 亚型； (c)鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株或其感染毒株亚型； (d)鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株核酸或其含有的毒株 核酸亚型； (e)区分或辅助区分人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株和人乙型肝炎病毒， 或， 区分或辅助 区分权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114934135 A 2人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株和人丙型肝炎病毒。 6.一种试剂盒， 包括权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的成套PCR试 剂； 所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)： (a)扩增人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株po l‑env部分序列； (b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株或其 亚型； (c)鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株或其感染毒株亚型； (d)鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株核酸或其含有的毒株 核酸亚型； (e)区分或辅助区分人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株和人乙型肝炎病毒， 或， 区分或辅助 区分 人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株和人丙型肝炎病毒； 或， 所述试剂盒的制备方法， 包括将权利要求3或4所述成套PCR试剂中各物质单独包装 的步骤。 7.根据权利要求5所述的应用或权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于： 所述人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株亚型为A、 B/B ’、 C、 D、 F等纯亚型毒株， 或CRF01_AE重组毒 株、 CRF07_BC重组毒株、 CRF08_BC重组毒株、 CRF55_01B重组毒株、 CRF59_01B重组毒株及各 个重组毒株的二代重组毒株等重组毒株。 8.一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株的方法， 包括如下步骤： (1)以待测病毒的核酸为模板， 用权利要求1或2中的引物1和引物2进行扩增， 得到第一 轮PCR扩增产物； (2)以第一轮PCR扩增产物为模板， 用权利要求1或2中的引物3和引物4进行扩增， 得到 第二轮PCR扩增产物； (3)检测所述第二轮PCR扩增产物， 若第二轮PCR扩增产物中具有 1500‑2000bp或1715bp 的特异DNA片段， 则所述待测病毒为 或候选为人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株； 如果第二轮PCR扩增 产物中不具有1500 ‑2000bp或1715bp的特异DNA片段， 则所述待测病毒不为 或候选不为人免 疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株； 或， 一种鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病 毒Ⅰ型毒株的方法， 包括如下步 骤： (1)以待测者的核酸为模板， 用权利 要求1或2中的引物1和引物2进行扩增， 得到第一轮 PCR扩增产物； (2)以第一轮PCR扩增产物为模板， 用权利要求1或2中的引物3和引物4进行扩增， 得到 第二轮PCR扩增产物； (3)检测所述第二轮PCR扩增产物， 若第二轮PCR扩增产物中具有 1500‑2000bp或1715bp 的特异DNA片段， 则 所述待检者感染或候选感染人免疫缺陷病毒； 如果第二轮PCR扩增产物 中不具有1500 ‑2000bp或1715bp的特异DNA片段， 则所述待检者未感染或候选未感染人免疫 缺陷病毒。 或， 一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒 Ⅰ型毒株的方法， 包括如下步骤： 步骤I： 以待测病毒的核酸为模板， 用权利要求2中的所述引 物DR‑1和引物DR ‑2进行扩 增， 得到扩增产物， 得到第一轮PCR扩增产物； 再以所述第一轮PCR扩增产物为模板， 用权利 要求2中的所述引物DR ‑3和引物DR ‑4进行权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 114934135 A 3