(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210500956.2 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 中国科学院水生 生物研究所 地址 430072 湖北省武汉市武昌区东湖南 路7号 (72)发明人 张倩倩　李爱华　吴振兵　 (74)专利代理 机构 武汉宇晨专利事务所(普通 合伙) 42001 专利代理师 陈晓宁　王敏锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病诊断中的 用途及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种两种蛋白在中华绒螯蟹 水瘪子病诊断中的用途及试剂盒， 用途包括中华 绒螯蟹水瘪子病的诊断指标： 与健康中华绒螯蟹 相比， 病蟹肝胰腺中2 ‑氨基粘液半醛脱氢酶 ‑ like异构体X1基因的表达上调幅度为1.8 ‑2.8 倍， 同时细胞色素P450酶系CYP2的表 达下调幅度 为20.2‑45.5％。 试剂盒包括： SYBR  Premix Ex  TaqTM II， 1对2‑氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1 扩增的正反向引物， 1对细胞色素P450基因扩增 的正反向引物， 1对内参β ‑Actin基因的正反向 引物和双蒸水ddH2O， 阳性对照DNA和阴性对照 DNA， 使用说明书。 使用本试剂盒之前， 对样品进 行河蟹肝胰腺 组织mRNA提取和反转录合成cDNA 。 本发明不需要绘制标准曲线， 只需要测定病蟹和 健康蟹肝胰腺中目标基因的相对表达量即可， 大 大降低了 工作量。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图1页 CN 114875133 A 2022.08.09 CN 114875133 A 1.两种蛋白在中华绒螯蟹水瘪子病 诊断中的用途， 包括中华绒螯蟹水瘪子病的诊断指 标： 与健康中华绒螯蟹相比， 病蟹肝胰腺中2 ‑氨基粘液半醛脱氢酶 ‑like异构体X1基因的 表达上调幅度为1.8 ‑2.8倍， 同时细胞色素P45 0酶系CYP2的表达下调幅度为20.2 ‑45.5％。 2.如权利要求1所述的用途， 其特 征在于： 所述的2‑氨基粘液半醛脱氢酶 ‑like异构体X1基因表达水平和细胞色素P450酶系CYP2 基因表达水平是指采用定量PCR技 术测得的mRNA水平。 3.如权利要求2所述的用途， 其特 征在于： 定量测定所述的2 ‑氨基粘液半醛脱氢酶 ‑like异构体X1基因表达水平的正向和反向序 列分别为SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示。 4.如权利要求3所述的用途， 其特 征在于： 定量测定所述的2 ‑氨基粘液半醛脱氢酶 ‑like异构体X1基因表达水平的正向和反向引 物是基于序列SEQ  ID NO:3所对应的蛋白质序列来设计的。 5.一种诊断中华 绒螯蟹水瘪子病的实时定量PCR试剂盒， 其特 征在于： 包括 SYBR Premix Ex TaqTMII； 1对2‑氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1扩增的正反向引物； 1对细胞色素P45 0基因扩增的正反向引物； 1对内参β ‑actin基因的正反向引物； 双蒸水ddH2O。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于： 所述的SYBR  Premix Ex TaqTMII， 含有Real  Time PCR反应的最适浓度 Green  I， 是一种2 ×浓度的Premix  Type试剂； 所述的2 ‑氨基粘液半醛脱氢酶异构体X1的扩增正向引物为Es ‑CXE1‑F： GTTCAGAAGACTTGCAGCGT， 反向引物为Es ‑CXE1‑R： GGAAAGGTAGTGGAGGCTGT； 所述的细胞色素P45 0基因的扩增正向引物为ESC YP‑7： CCAAGCTGGTGGAGACGAT TC， 反向引物为ESC YP‑8： AGATCACGT TGACCACGGCC； 所述的内标β ‑Actin的扩增引物为Acti n‑F： GCATCCACGAGAC CACTTACA/Acti n‑R： CTCCTGCTTGCTGATC CACATC。 7.如权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于： 还 包括 1份河蟹肝胰腺组织DNA提取操作指南； Tli RnaseH(耐热性RNaseH)， 在以cDNA作为模板进行PCR反应时， 最大限度抑制由于 cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用， 1份操作指南及注意事项。 8.如权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于： 还 包括 标准阳性DNA模板： 河蟹肝胰腺组织的DNA(5 0ng/ μl)； 标准阴性DNA模板： 草鱼肝脏组织的DNA(5 0ng/ μl)。 9.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 还包括对样品的预处理： 使用本试剂盒之权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875133 A 2前， 对样品进行河蟹肝胰腺组织mRNA提取和反转录合成cDNA， 以作为本试剂盒的DNA模板 。 10.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 反应体系及PCR循环参数如下： 在总体积 为25 μL的反应液体中， 含有2 μL  cDNA模板， 正反向引物各0.5 μL， 引物浓度为10 μm/L， 12.5 μL   Premix Ex TaqTMII(2×)以及9.5 μLd dH2O； 反应条件如下： 95℃变性3 0s； 95℃5s,6 0℃30s,40个循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875133 A 3