(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210502980.X (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 上海睿璟生物科技有限公司 地址 201100 上海市闵行区召楼路3 632号2 幢5层 (72)发明人 龚伟　李雯　石涵　杨峰　洪跟东　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 专利代理师 陈艳娟　许亦琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于甲状 腺结节良恶性判别的生物标志物、 多基因联检试剂盒及应用 (57)摘要 本发明属于生物医药领域， 公开了一种用于 甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、 多基因联 检试剂盒及应用。 所述生物标志物组包含8种DNA 单碱基突变和4种基因融合中的至少一种； 所述8 种DNA单碱基突变选自BRAF基因V 600E、 TERT基因 C228T/C250T、 KRAS基因G 12C/G12V/ Q61R、 NRAS基 因Q61R、 HRAS基因Q61R， 所述4种基因融合选自 CCDC6‑RET(Exon1 ‑Exon12)、 NCOA4 ‑RET(Exon8 ‑ Exon12)、 PAX8 ‑PPARG(Exon10 ‑Exon2)、 ETV6 ‑ NTRK3(Exon4 ‑Exon14)。 本发明的方法和试剂盒 检测灵敏度高、 特异性高， 应用场景广泛。 权利要求书4页 说明书32页 序列表19页 附图15页 CN 114807350 A 2022.07.29 CN 114807350 A 1.用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物组， 其特征在于， 其包含8种DNA单碱基突 变和4种基因融合中的至少一种； 所述8种DNA单碱基突变选自BRAF基因V600E、 TERT基因 C228T/C250T、 KRAS基因G12C/G12V/Q61R、 NRAS基因Q61R、 HRAS基因Q61R， 所述4种基因融合 选自CCDC6 ‑RET(Exon1‑Exon12)、 NCOA4 ‑RET(Exon8 ‑Exon12)、 PAX8 ‑PPARG(Ex on10‑Exon2)、 ETV6‑NTRK3(Exo n4‑Exon14)。 2.如权利要求1所述的生物标志物组或其检测物在制备甲状腺结节良恶性判别产品中 的用途。 3.如权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述检测物为特异性检测引物和/或特异性 检测探针。 4.如权利要求3所述的用途， 其特 征在于， 所述特异性检测引物包括以下引物对A ～J至少任一： 针对BRAF基因V600E的引物对A， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 1～3任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 4～6任一； 针对TERT基因C228T的引物对B， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 10～12任一， 下游引物 选自序列SEQ  ID NO： 13～15任一； 针对TERT基因C250T的引物对C， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 19～21任一， 下游引物 选自序列SEQ  ID NO： 22～24任一； 针对KRAS基 因G12C的引物对D， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 28～30任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 31～3 3任一； 针对KRAS基 因G12V的引物对E， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 37～39任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 40～42任一； 针对KRAS基 因Q61R的引物对F， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 46～48任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 49～51任一； 针对NRAS基 因Q61R的引物对G， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 55～57任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 58～6 0任一； 针对HRAS基 因Q61R的引物对F， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 64～66任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 67～69任一； 针对CCDC6 ‑RET(Exon1 ‑Exon12)的引物对G， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 73～75任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 76～78任一； 针对NCOA4 ‑RET(Exon8 ‑Exon12)的引物对H， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 82～84任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 85～87任一； 针对PAX8 ‑PPARG(Exon10 ‑Exon2)的引物对I， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 90～91任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 92～93任一； 针对ETV6 ‑NTRK3(Exon4 ‑Exon14)的引物对J， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 96～97任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 98～99任一； 所述特异性检测探针包括以下探针A ～J至少任一： 针对BRAF基因V6 00E的探针A， 其序列如SEQ  ID NO： 7～9任一所示； 针对TERT基因C2 28T的探针B， 其序列如SEQ  ID NO： 16～18任一所示； 针对TERT基因C25 0T的探针C， 其序列如SEQ  ID NO： 25～27任一所示；权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114807350 A 2针对KRAS基因G12C的探针D， 其序列如SEQ  ID NO： 34～3 6任一所示； 针对KRAS基因G12 V的探针E， 其序列如SEQ  ID NO： 43～45任一所示； 针对KRAS基因Q61 R的探针F， 其序列如SEQ  ID NO： 52～54任一所示； 针对NRAS基因Q61 R的探针G， 其序列如SEQ  ID NO： 61～6 3任一所示； 针对HRAS基因Q61 R的探针F， 其序列如SEQ  ID NO： 70～72任一所示； 针对CCDC6‑RET(Exon1‑Exon12)的探针G， 其序列如SEQ  ID NO： 79～81任一所示； 针对NCOA4 ‑RET(Exon8‑Exon12)的探针H， 其序列如SEQ  ID NO： 88～89任一所示； 针对PAX8 ‑PPARG(Exo n10‑Exon2)的探针I， 其序列如SEQ  ID NO： 94～95任一所示； 针对ETV6 ‑NTRK3(Exo n4‑Exon14)的探针J， 其序列如SEQ  ID NO： 100～101任一所示。 5.一种检测物， 其特 征在于， 所述检测物为特异性检测引物和/或特异性检测探针； 所述特异性检测引物包括以下引物对A ～J至少任一： 针对BRAF基因V600E的引物对A， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 1～3任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 4～6任一； 针对TERT基因C228T的引物对B， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 10～12任一， 下游引物 选自序列SEQ  ID NO： 13～15任一； 针对TERT基因C250T的引物对C， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 19～21任一， 下游引物 选自序列SEQ  ID NO： 22～24任一； 针对KRAS基 因G12C的引物对D， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 28～30任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 31～3 3任一； 针对KRAS基 因G12V的引物对E， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 37～39任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 40～42任一； 针对KRAS基 因Q61R的引物对F， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 46～48任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 49～51任一； 针对NRAS基 因Q61R的引物对G， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 55～57任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 58～6 0任一； 针对HRAS基 因Q61R的引物对F， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 64～66任一， 下游引物选 自序列SEQ  ID NO： 67～69任一； 针对CCDC6 ‑RET(Exon1 ‑Exon12)的引物对G， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 73～75任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 76～78任一； 针对NCOA4 ‑RET(Exon8 ‑Exon12)的引物对H， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 82～84任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 85～87任一； 针对PAX8 ‑PPARG(Exon10 ‑Exon2)的引物对I， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 90～91任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 92～93任一； 针对ETV6 ‑NTRK3(Exon4 ‑Exon14)的引物对J， 上游引物选自序列SEQ  ID NO： 96～97任 一， 下游引物选自序列SEQ  ID NO： 98～99任一； 所述特异性检测探针包括以下探针A ～J至少任一： 针对BRAF基因V6 00E的探针A， 其序列如SEQ  ID NO： 7