(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210497094.2 (22)申请日 2022.05.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574557 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 上海美迪西生物医药股份有限公 司 地址 201299 上海市浦东 新区川大路585号 专利权人 美迪西普胜医药 科技 （上海） 有限 公司 (72)发明人 章登吉　袁雨琼　白振振　梁冉冉　 陈春麟　朱焕章　 (74)专利代理 机构 上海瀚桥专利代理事务所 (普通合伙) 31261 专利代理师 郑优丽　牛彦存(51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 112322706 A,2021.02.0 5 CN 110218770 A,2019.09.10 审查员 梁韶 (54)发明名称 NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检 测试剂盒 (57)摘要 本发明公开一种NK细胞治疗产品通用型临 床前生物分布 检测试剂盒。 本发明还涉及SEQ  ID  No.1所示的基因序列在区分人源NK细胞和非人 源动物基因中的特异性应用。 通过提出特异性 DNA序列， 可以特异性区分人源NK细胞来源的DNA 序列和非人源动物基因来源的DNA序列， 并基于 该特异性DNA序列 构建区分人源NK细胞基因和非 人源动物 基因的qPCR体系， 为NK细胞及其衍生细 胞治疗类产品提供引物对和探针组， 并成功设计 一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检 测试剂盒， 从而 为NK细胞及其衍生细胞治疗类产 品的临床前研究提供便利。 权利要求书1页 说明书15页 序列表2页 附图3页 CN 114574557 B 2022.09.09 CN 114574557 B 1.SEQ ID No.1 所示的基因序列在区分人源NK细胞和小鼠基因中的特异性应用。 2.检测SEQ  ID No.1 所示的基因序列的试剂在制 备人源NK细胞治疗产品通用型临床 前在小鼠中生物分布检测试剂盒中的应用。 3.用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物对， 其特征在于， 所述引物对用于扩 增SEQ ID No.1所示的目标基因序列； 所述引物对由Primer ‑F正向引物和Primer ‑R反向引 物组成； 所述Primer ‑F正向引物为SEQ  ID No.2所示引物； 所述Pri mer‑R反向引物为SEQ  ID  No.3 所示引物。 4.根据权利要求3所示的引物对， 其特征在于， 所述正向引物和反 向引物的解链温度独 立地为55±1℃。 5.根据权利要求3所示的引物对， 其特征在于， 所述正向引物和反 向引物的解链温度差 值不超过2℃。 6.权利要求3至5中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物对在 制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。 7.用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物探针组， 其特征在于， 所述引物探针 组包括SEQ  ID No.4所示的基因序列在5 ´端偶联发光基团和3 ´端偶联淬灭基团的Taqman探 针以及权利要求3 至5中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物对。 8.根据权利要求7 所示的引物探针组， 其特 征在于， 探针的解链温度为6 5±1℃。 9.根据权利 要求7所示的引物探针组， 其特征在于， 探针的解链温度高于Primer ‑F正向 引物或者Primer ‑R反向引物10 ±1℃。 10.权利要求7至9中任一项所述的用于特异性 区分人源NK细胞和小鼠基因 的引物探针 组在制备NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒中的应用。 11.NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求3 至5中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物对。 12.NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求7 至9中任一项所述的用于特异性区分人源NK细胞和小鼠基因的引物探针组。 13.根据权利要求11或12所述的NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒， 其特征在于， 还 包括标准质粒。 14.根据权利要求13所述的NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒， 其特 征在于， 使用标准质粒构建标准曲线， 使用引物对或引物探针组构建qP CR检测体系， 通过扩 增反应得到特异性的SEQ  ID No.1 所示的目标基因序列， 并识别人源NK细胞和小鼠基因的 差异。 15.根据权利要求14所述的NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒， 其特 征在于， 扩增反应条件为： 94 ‑96℃ / 3‑4分钟； 94 ‑96℃ / 15‑20秒； 54‑56℃ / 0.75‑1分 钟； 循环次数： 3 5‑40次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574557 B 2NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒 [0001]NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒。 技术领域 [0002]本发明涉及生物分布分析、 药代动力学、 毒代动力学、 细胞治疗药物安全性评价和 临床前研究领域， 尤其涉及一种NK细胞治疗产品通用型临床前生物分布检测试剂盒。 背景技术 [0003]自然杀伤细胞(Natural  Killer cell, NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞， 其分 化、 发育依赖于骨髓及胸腺微环 境， 主要分布在骨髓、 外周血、 肝、 脾、 肺和淋巴结。 NK细胞不 同于T细胞和B细胞， 是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋 巴细胞。 近年来， 伴 随着细胞基因治疗领域的不断发展， T细胞被生物医药领域研究人员开 发成嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(  Chimeric  Antigen  Receptor  T‑Cell  Immunotherapy,  CAR‑T)治疗产品， NK细胞的治疗作用也备受关注。 目前已经有各种各样的 NK细胞改造型产品被用于医药研发， 例如基于病毒载体转导的细胞构建CAR ‑NK， 或基于胞 外偶联方式构建CAR ‑NK的细胞治疗产品， 双靶点或多靶点CAR ‑NK， 基因编辑的NK细胞类产 品。 [0004]细胞治疗的NK类产品离不开临床前的药代动力学和生物分布研究。 对于病毒载体 导入在NK细胞上表达的CAR可以基于转入基因即CAR部 分的序列进行特异性检测。 当前常用 的技术手段是对每一个新的CAR ‑NK根据CAR序列 分别基于qPCR技术检测特定的CAR， 可是， 基于转入基因的检测方式对于每一个转入基因针对不同的分子都需要构建独立的qPCR检 测方法， 这造成早期临床前研究 的工作量巨大， 也需要耗费较长的时间， 对快速推进早期研 究具有不利的时间成本。 因此， 建立通用的且特异性地直接区分人源NK细胞和实验动物如 小鼠来源的基因组DNA的方法体系， 可以为临床前研究提供快捷和便利， 具有重要的工业价 值和经济效益。 [0005]另外， 对于细胞外直接偶联CAR部分的CAR ‑NK或其它改造型的NK细胞治疗产品， 并 不适合基于CAR序列构建 qPCR的方法。 例如直接偶联的CAR， CAR本身就已经表达成蛋白性质 的成品进行偶联， 因此DNA层面的仅基于CAR的检测方法则不再适用。 为了表征NK本身的药 代动力学和生物分布行为， 必须基于NK细胞本身基因序列构建能特异 性区分人源NK细胞的 基因和动物基因的定量P CR方法。 如何找到特异的DNA序列进 行上述区分是本领域经常碰到 的难题。 具体来说， 虽然CD 56分子是NK细胞表 面的标志性分子， 但实际上此分子的基因在 小 鼠和人NK细胞甚至其它细胞或组织均存在。 找到怎样的基因特异 性序列应用于NK细胞药代 与分布， 并成功构建对应的检测方法是本领域人员一 直面对的重要挑战。 发明内容 [0006]针对上述问题， 本发明创新性地找到并提出特异性D NA序列， 可以特异性区分人源 NK细胞来源的DNA序列和非人源动物基因来源的DNA序列， 并基于该特异性DNA序列构建区说　明　书 1/15 页 3 CN 114574557 B 3