(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210495527.0 (22)申请日 2022.05.08 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 叶恭银　李冉　党聪　汪芳　方琦　 姚洪渭　 (74)专利代理 机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 专利代理师 金祺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条 形码测序法 (57)摘要 本发明公开了一种稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 包括以下步骤： 1)、 设定稻田节 肢动物eDNA的取样； 2)、 设定PCR扩增所用的引 物； 3)、 将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取， 所得模板DNA利用步骤2)所得引物进行PCR扩增； 4)、 步骤3)所得的PCR产物先进行纯化， 而后进行 高通量测序。 本发明的方法可以快速高效实现稻 田节肢动物种类鉴定 。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图1页 CN 114891867 A 2022.08.12 CN 114891867 A 1.稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1)、 设定稻田节肢动物eDNA的取样； 2)、 设定PCR扩增所用的引物； 3)、 将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取， 所得模板DNA利用步骤2)所得引物进行PCR 扩增； 4)、 步骤3)所 得的PCR产物先进行 纯化， 而后进行高通 量测序。 2.根据权利要求1所述的稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 其特 征在于： 所述步骤1)中： 取样包括水稻抽穗期的稻田土层、 稻田水层、 水稻植株清洗液、 水稻花 粉。 3.根据权利要求2所述的稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 其特 征在于： 当取样为稻田土层时， 对水稻抽穗期的稻田土壤， 用6 0mL环刀进行 取样； 当取样为稻田水层时， 对水稻抽穗期的稻田水， 用5 0mL离心管进行 取样； 当取样为水稻植株清洗液时， 对水稻抽穗期的水稻单株用1000mL去离子水对植株根部 以上进行清洗， 收集清洗液； 当取样为水稻花粉时， 对水稻抽穗期的稻穗收集 花粉。 4.根据权利要求1～3任一所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法， 其特征在 于： PCR扩增所用的引物为mlCOI intF/jgHCO2198R； mlCOIintF： GGWACWGGWTGAACWGTWTAY CCYCC jgHCO2198R： TA AACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA。 5.根据权利要求 4所述的稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 其特 征在于： 扩增体系为： 5 ×FastPfu Buffer 4μL， dNTPs  2μL， Forward  Primer0.8μL， Reverse   Primer0.8 μL， FastPfu  Polymerase 0.4 μL， 模板DNA  10ng， 加d dH2O至20 μL； 反应条件为： 95℃5mi n； 95℃30s， 55℃30s， 72℃45s， 共3 5个循环； 72℃10mi n。 6.根据权利要求5所述的稻田节肢动物eDNA宏条 形码测序的方法， 其特 征在于： 当为稻田土层样品时， 采用HiPure  Soil DNA Kit提取DNA； 当为水稻花粉样品时， 采用HiPure  Universal DNA Kit提取DNA； 当以水稻植株清洗液和稻田水层为样品时， 先采用孔径0.45μm的微孔滤膜进行抽滤， 之后将滤膜剪碎裂解， 采用HiPure  Water DNA Kit提取DNA。 7.根据权利要求1～6任一所述的稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方法， 其特征在 于： 将步骤4)高通量测序结果中得到的OTU序列与NCBI网站的nt公共数据库进行比对， 从 而获得取样样品中的稻田节肢动物种类。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891867 A 2用于稻田节肢动物群落研究的环境 DNA宏条形码测序法 技术领域 [0001]本发明属于分子生态学领域， 涉及用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形 码测序方法。 背景技术 [0002]稻田节肢动 物群落研究对于提高稻田生态系统稳定性和多样性至关重要。 传统的 稻田节肢动物群落研究大多数是基于对所采集的所有节肢动物种类鉴定与数量测定的基 础上而开展的， 需要耗费大量的精力， 且鉴定人员需要丰富的经验， 难以实现节肢动物群落 种类与数量的全貌和精准确定。 同时传统的取样方法在取样过程中会对原有稻田生态系统 造成影响。 基因测序技术和生物信息学的发展， 可以高效精 准地完成物种分子鉴定， 为生态 学调查提供了新的研究方法和思路(Wilson  et al.,2019)。 高通量测序技术可以对各种环 境样本DNA(environmental  DNA,eDNA)进行快速测序， 将测序数据与已有的DNA条形码相结 合形成了eDNA宏条形码技术(eDNA  metabarcoding)(Coissac  et al.,2012)。 eDNA是指生 物释放到水、 空气及土壤等环 境中的短DNA片段， 目前eDNA宏条形码技术已经在淡水和海洋 生态系统生物多样性调查、 入侵生物监测等方面发挥着 重要作用(徐浩等,2014； Deiner  et  al.,2017)。 对海洋牡蛎礁进行取样， 采用线粒体细胞色素氧化 酶COI基因对样品进行PCR扩 增， 之后通过高通量测序鉴定出体型极其微小且罕见的海洋底栖生物(Leray  and  Knowlton,2015)。 Goldberg等(2 013)运用eDNA宏条形码测序发现了一种新入侵新西 兰的淡 水螺Potamopyrgus  antipodarum。 [0003]近年来， 这项技术也开始应用于陆地生态系统节肢动物群落生态学研究中。 通过 收集牧草的花朵进行高通量测序， 可以较为快速准确的计算出草原上节肢动物群落的组成 和物种相对丰富度(Thomsen  and Sigsgaard,2 019)。 陆地生态系统eDNA宏条形码测序对于 取样方法有较高的要求， Valentin等(2020)采用 “喷雾收集法 ”和“树干滚筒法 ”两种新方法 收集了植被表 面的eDNA， 用于调查森 林中入侵害虫斑衣蜡蝉Lycorma  delicatula的种群数 量。 目前， eDNA宏条形码在稻田生态系统中的应用还未有报道， 因此本行业期待建立稻田 eDNA宏条形码测序的方法体系， 从而期待大大提高稻田节肢动物群落调查的效率和精准 度。 发明内容 [0004]本发明要解决的问题是提供一种用于稻田节肢动 物群落研究的环境DNA宏条形码 方法。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供一种稻田节肢动物eDNA宏条形码测序的方 法， 其包括以下步骤： [0006]1)、 设定稻田节肢动物eDNA的取样； [0007]2)、 设定PCR扩增所用的引物； [0008]3)、 将步骤1)取样所得样品进行DNA的提取， 所得模板DNA利用步骤2)所得引物进说　明　书 1/8 页 3 CN 114891867 A 3