(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221049349 9.9 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 福建佰孟医学 科技有限公司 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街 镇 福州大学科技园2号楼 201 (72)发明人 张荣才　 (74)专利代理 机构 福州科扬专利事务所(普通 合伙) 35001 专利代理师 魏珊珊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量 PCR检测引物、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开一种猪流行性腹泻病毒的通用 型荧光定量PCR检测引物， 所述检测引物如下所 示： 上游引物PEDV ‑F： TTGCTAGGCTCGCARGTAC， 其 为SEQID  NO .1序列； 下游引物PEDV ‑R ： CGGACGACRAATGCGTGGGT， 其为SEQ  IDNO.2序列； 同时其用TaqMan探针荧光定量检测法， 建立了针 对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方法， 可以有 效区分野毒感染该方法具有良好的特异性、 敏 感 性和重复性， 为猪流行性腹泻的鉴别诊断提供了 良好的技 术支持。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114752709 A 2022.07.15 CN 114752709 A 1.一种猪流行性腹泻病 毒的通用型荧光定量PCR检测引物， 其特征在于： 所述检测引物 如下所示： 上游引物PEDV ‑F： TTGCTAGGCTCGCARGTAC， 其 为SEQ ID NO.1序列； 下游引物PEDV ‑R： CGGACGACRA ATGCGTGGGT， 其为SEQ ID NO.2序列。 2.一种猪流行性腹泻病 毒的通用型荧光定量PCR检测试剂 盒， 其特征在于： 包括如权利 要求1所述的检测引物和TaqMan 荧光探针； 所述特异性TaqMan 荧光探针如下 所示： 荧光探针PEDV ‑P： FAM‑TCTGGCCCTGCCCACCACGT ‑BHQ1， 其为SEQ  ID NO.3序列， FAM为荧 光报告基因， BHQ1为 荧光淬灭基因。 3.如权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病 毒的通用型荧光定量PCR检测试剂 盒， 其特 征在于： 所述试剂盒反应 体系中上 下游引物浓度为0.1 ‑1 μm， 荧光探针浓度为0.1 ‑1 μm。 4.一种猪流行性腹泻病 毒的通用型荧光定量PCR检测方法， 其特征在于： 利用上述权利 要求2至3任一所述的试剂盒进行猪流行性腹泻病毒检测。 5.如权利要求4所述的一种猪流行性腹泻病 毒的通用型荧光定量PCR检测方法， 其特征 在于， 具体包括以下步骤： (1)反应体系配制： 取出PEDV  Mix、 One Step‑RT‑qPCR酶、 阳性对照和阴性对照， 置于室 温下完全 融解， 充分颠倒混匀后短暂离心； 按照PEDV  Mix和酶系以(11.5 ×n)μL+(1×n)μL ＝(12.5×n)μL的比例计算所需配制反应数， 充分混匀， 配制成PCR反应液； 其中， PEDV  Mix 包括上下游引物、 荧 光探针、 buf fer和过滤水； (2)根据检测样品的数量向每个PCR反应管中加入12.5 μL  PCR反应液， 然后取12.5 μL的 阴性对照、 待检样品RNA、 阳性对照分别加入到不同的PCR反应管中， 盖紧管盖， 将P CR反应管 瞬时离心； (3)荧光PCR操作： 将瞬时离心好的PCR管放入荧光PCR检测仪内， 采用一步法使逆转录 和扩增在同一管中进行， 按照如下反应设置： 第一阶段， 50℃逆转录15min； 第二阶段， 95℃ 预变性2.5 ‑3min； 第三阶段， 93 ‑95℃变性10s， 55 ‑60℃延伸30s， 共40 ‑45个循环； 荧光收集 在第二阶段每次循环的5 5‑60℃延伸时进行， 选择 FAM荧光检测通道， 收集FAM荧 光信号； (4)结果判定： 通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值， 同时观察报告基团FAM有 无扩增曲线出现。 6.如权利要求2所述的的试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测 的TaqMan实时荧 光PCR试剂中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752709 A 2一种猪流行性腹泻病毒 的通用型荧光定量PCR检测引物、 试剂 盒及应用 技术领域 [0001]本发明属于病毒分子生物学， 具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量 PCR检测引物、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]猪流行性腹泻病毒(PEDV)会引起猪接触性肠道传染病， 以呕吐、 腹泻和脱水为特 征， 可发生于任何年龄的猪， 年龄越小， 症状越重， 死亡率越高。 哺乳猪、 架子猪或肥育猪的 发病率很高， 尤以哺乳猪受害最为严重， 母猪发病率变动很大， 约为 15‑90％。 猪流行性腹泻 病毒(PorcineEpidemicDiarrh eaVirus， PEDV)系冠状病毒科冠状病毒属成员， 属于 Ⅰ类冠状 病毒， α 冠状病毒属， 猪流行性腹泻病毒(PEDV)经口鼻感染后直接进入小肠， 在小肠上皮细 胞增殖， 引起小肠绒毛吸收上皮细胞病变、 损伤、 脱落和小肠绒毛萎缩， 导致肠内酶活性降 低， 吸收功能障碍， 肠道内渗透压增高， 引发渗透性腹泻， 最 终造成掉膘、 降低饲料吸收利用 率， 导致猪的死 亡， 是影响全球养猪业的最重要病毒之一。 [0003]猪流行性腹泻病毒(PEDV)是有囊膜的单股正链RNA病毒， 基因组全长28kb， 有七个 开放阅读框， 编码4个结构蛋白(纤突蛋白(S)、 小膜蛋白(sM)、 膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)) 和3个非结构蛋白(ORF1a、 ORF1b和ORF3)。 现有技术中常常由于N蛋 白能够参与病毒基因组 的转录， 能与细胞膜和磷脂结合， 促进病毒核心的形成以及病毒RNA的组装， 进而利用N蛋白 来建立针对PEDV分子生物学诊断技术。 专利 号为CN103866050A的中国专利公开了 “猪流行 性腹泻病毒荧光定量P CR检测方法及其引物 ”， 其中， 具体公开了根据猪流行性腹泻病毒的N 基因序列设计引物， 通过对荧光定量反应条件的优化， 使其具有较好的特异 性和重复性， 用 于PEDV的快速检测。 [0004]荧光PCR技术已经广泛应用在各种猪病的诊断中， 技术成熟， Taqman探针法荧光 PCR技术与染料法荧光P CR相比多了一条探针， 特异 性更好， 应用广泛， 通过对不同探针标记 不同的发光基团可实现病原多重检测， 与传统P CR检测比， 检测速度快， 敏感性高， 不需要开 盖电泳检测PCR产物， 减少实验室气溶胶污染风险。 [0005]PEDV的M蛋白作为一个膜糖蛋白， 在PEDV病毒的遗传进化过程中很少发生突变， 从 而保证宿主识别的一致性， 因此M基因具有高度的保守性。 本申请通过PEDV不同毒株M基因 的序列比对， 选取了M基因的中段保守序列设计引物及探针， 能够实现最大限度 识别PEDV的 所有毒株。 发明内容 [0006]本发明目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量PCR检测引物及应 用， 其中采用TaqMan探针荧光定量检测法， 建立了针对猪流行性腹泻病毒M基因的检测方 法， 可以有效区分野毒感染该方法具有良好的特异 性、 敏感性和重复性， 为猪流行性腹泻的 鉴别诊断提供了良好的技 术支持。说　明　书 1/7 页 3 CN 114752709 A 3