(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210494641.1 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 天津见康华美医学诊断技 术有限公 司 地址 300000 天津市西青区西青经济技 术 开发区兴华三支路5号赛达检测认证 园A2座101b号厂房 (72)发明人 汝昆　张蕾　蔺亚妮　 (74)专利代理 机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 1 1246 专利代理师 高雪莲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测PCM1-JAK2融合基因的多重PCR方 法、 引物探 针组合与试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物医学技术领域， 提供了一种 检测PCM1 ‑JAK2融合基因的多重PCR方法、 引物 探 针组合与试剂盒， 引物探针组合包括引物探针组 合A1和引物探针组合A2： 引物探针组合A1包括上 游引物PCM1 ‑E23‑F、 PCM1‑E26‑F、 PCM1‑E28‑F、 PCM1‑E30‑F、 PCM1‑E36‑F、 下游引物JAK2 ‑E9‑R、 JAK2‑E12‑R和探针JAK2 ‑E9‑Probe、 JAK2 ‑E12‑ Probe， 引物 探针组合A2包 括上游引物PCM1 ‑E23‑ F、 PCM1‑E26‑F、 PCM1‑E28‑F、 PCM1‑E30‑F、 PCM1‑ E36‑F、 下游引物JAK2 ‑E11‑R和探针JAK2 ‑E11‑ Probe， 试剂盒包括检测体系PCR反应液、 淋巴细 胞分离液， 通过将引物探针分为两个组合， 最大 限度的涵盖各种融合方式， 减少引物数量， 防止 相互干扰， 本发 明设计的引物探针组合可同时检 测已知的融合方式及可能存在的未知融合方式， 能够同时检测各种融合方式， 降低检测成本； 采 用了基于Taqman探针的多重PCR技术， 保证了检测扩增的特异性。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图5页 CN 114958985 A 2022.08.30 CN 114958985 A 1.一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的引物探针组合， 其特征在于， 所述引物探针组合包括 引物探针组合A1和引物探针组合A 2： 所述引物探针组合A1包括上游引物PCM1 ‑E23‑F、 PCM1‑E26‑F、 PCM1‑E28‑F、 PCM1‑E30‑ F、 PCM1‑E36‑F、 下游引物JAK2 ‑E9‑R、 JAK2‑E12‑R和探针JAK2 ‑E9‑Probe、 JAK2 ‑E12‑Probe， 其碱基序列如下 所示： PCM1‑E23‑F： CCAGCCTGGCATCTAAAGATA PCM1‑E26‑F： CTAGTGAGAGC CTTGCTACTAC PCM1‑E28‑F： CTGGTGCAGGTACTACAGT T PCM1‑E30‑F： TGATGAGAGCA AAGAGTTTGTAAAG PCM1‑E36‑F： GCTGGAAGTCCTGATACTGA JAK2‑E9‑R： ATGTGCATCTGCAGT TAATCTATAA JAK2‑E12‑R： TGTTGGTGAGGTTGGTACATC JAK2‑E9‑Probe： FAM ‑CCATCAATTAATGACACGA AAGACA‑MGB JAK2‑E12‑Probe： HEX‑ACACCATTCGTTCTGAAGACTAGA ‑MGB 所述引物探针组合A2包括上游引物PCM1 ‑E23‑F、 PCM1‑E26‑F、 PCM1‑E28‑F、 PCM1‑E30‑ F、 PCM1‑E36‑F、 下游引物JAK2 ‑E11‑R和探针JAK2 ‑E11‑Probe， 其碱基序列如下 所示： PCM1‑E23‑F： CCAGCCTGGCATCTAAAGATA PCM1‑E26‑F： CTAGTGAGAGC CTTGCTACTAC PCM1‑E28‑F： CTGGTGCAGGTACTACAGT T PCM1‑E30‑F： TGATGAGAGCA AAGAGTTTGTAAAG PCM1‑E36‑F： GCTGGAAGTCCTGATACTGA JAK2‑E11‑R： GAACAGTTTCCATCTGGTAACAAT JAK2‑E11‑Probe： JOE ‑CACTGAGGTTGTACTCT TCATTCT‑MGB 2.根据权利要求1所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的引物探针组合， 其特征在于， 所述检测PCM1 ‑JAK2融合基因的引物探针组合中各探针的3 ’末端均标记MGB， 5 ’末端标记 FAM、 JOE或H EX。 3.根据权利要求2所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的引物探针组合， 其特征在于， 所述PCM1 ‑JAK2融合基因选自PCM1 ‑26/AK2‑9、 PCM1‑28/JAK2‑9、 PCM1‑30/JAK2‑9、 PCM1‑36/ JAK2‑9、 PCM1‑29/JAK2‑11、 PCM1‑36/JAK2‑11或PCM1‑23/JAK2‑12。 4.根据权利要求3所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的引物探针组合， 其特征在于， 还包括扩增作为内参的管家基因Abl的引物和探针， 其核苷酸序列如下： Abl‑F： TGGAGATAACACTCTA AGCATAACTAAAGGT Abl‑R： GATGTAGT TGCTTGGGACCCA Abl‑Probe： FAM ‑CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT‑TAM。 5.一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 所述试剂盒包括检测体系PCR反应液， 其特 征在于， 所述检测体系PCR反应液包括权利要求1所述的引物探针组合A1、 检引物探针组合 A2； 所述检测体系PCR反应液还 包括基因表达预混液、 内参基因Abl的引物和探针。 6.根据权利要求5所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958985 A 2剂盒还包括淋巴细胞分离液。 7.根据权利要求5所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒还包括样本RNA提取液， 所述样本RNA提取液包括TRIzol、 氯仿、 异丙醇、 75％乙醇和 DEPC水。 8.根据权利要求5所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒还包括阳性对照品、 阴性对照品和空白对照品， 所述阳性对照品为含有PCM1 ‑JAK2融合 基因cDNA序列的质粒溶液， 所述阴性对照品为不含有PCM1 ‑JAK2融合基因cDNA序列的质粒 溶液， 所述空白对照品为去离 子水。 9.根据权利要求8所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述 PCM1‑JAK2融合基因选自PCM1 ‑26/JAK2‑9、 PCM1‑28/JAK2‑9、 PCM1‑30/JAK2‑9、 PCM1‑36/ JAK2‑9、 PCM1‑29/JAK2‑11、 PCM1‑36/JAK2‑11或PCM1‑23/JAK2‑12。 10.根据权利要求8所述的一种检测PCM1 ‑JAK2融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述 PCM1‑26/JAK2‑9和PCM1‑28/JAK2‑9的检出浓度为至少为3copise/ul， 所述PCM1 ‑30/JAK2‑ 9、 PCM1‑36/JAK2‑9、 PCM1‑36/JAK2‑11和PCM1‑23/JAK2‑12的检出浓度为至少为30copise/ ul， 所述PC M1‑29/JAK2‑11的检出浓度为至少为3 03copise/ul。 11.一种检测PC M1‑JAK2融合基因的多重PCR方法， 其特 征在于， 包括 一下步骤： S1提取骨髓血样本中的RNA， 经RNA逆转录为cDNA样本； S2进行PCR扩增， 使用多重荧光PCR法， 得到特异性扩增产物； PCR扩增条件为50℃2min， 95℃10mi n， 95℃15s， 6 0℃1min(40个循环60℃处收集 荧光信号)； S3结果判读： S3‑1设定3‑15个循环的平均荧 光信号为基线； S3‑2使用软件分析荧光PCR结果， CT值＞37或无荧光PCR扩增曲线为阴性， CT值＜35为 阳性； 35≤CT值≤37为疑似阳性； S3‑3取10ulS3 ‑2中PCR反应后疑似阳性的标本的进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳， 在紫外 灯下与cDNA的分子量标记比较， 得 出阳性或阴性结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958985 A 3