(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210492989.7 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 鲍琦　孙秀兰　汤璐瑶　孙嘉笛　 张银志　纪剑　叶永丽　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 33/569(2006.01)G01N 21/64(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种无扩增时间分辨荧光侧向层析检测方 法检测沙门氏菌及耐药菌 (57)摘要 本发明公开了一种无扩增时间分辨荧光侧 向层析检测方法检测沙门氏菌及耐药菌， 属于快 速检测技术领域。 本发明基于CRISPR/Casl2a技 术设计得到针对沙门氏菌和沙门氏菌耐药菌株 的crRNA， 其中， SEQIDNO.1～SEQIDNO.8所示的 crRNA可以特异性的用于检测沙门氏菌和沙门氏 菌耐药菌株， SEQIDNO.9～SEQIDNO.14所示的 crRNA可以特异性的用于检测沙门氏菌耐药菌 株， 有效区分沙门氏菌和沙门氏菌耐药菌株。 本 发明提供的针对沙门氏菌耐药菌株的时间分辨 荧光试剂盒检测限LOD可达到1.8 ×102CFU/mL， 并且本精密度和准确度高， 可以实现有效的快速 筛查和检测。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图4页 CN 114807397 A 2022.07.29 CN 114807397 A 1.一种检测沙门氏菌及耐药沙门氏菌的无扩增时间分辨层析定量试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒包括侧向层析试纸条、 链霉亲和素修饰的时间分辨荧光微球、 5 ’端经生物素 修饰的核酸探针、 Cas12a核酸酶； 所述侧向层析 试纸条上包括捕获探针； 检测沙门氏菌的crRNA的序列如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.8任一所示； 检测耐药沙门氏菌 crRNA的序列如SEQ  ID NO.9～SEQ ID NO.14任一所示； 所述核酸探针的序列为5' ‑TTTTTTTTATT‑3'； 所述捕获探针的序列如SEQ  ID NO.15所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述侧向层析试纸条设置有背板、 玻璃 纤维样品垫、 硝酸纤维素膜和吸水垫； 样品垫、 硝酸纤维素膜和吸水纸， 所述硝酸纤维素膜 上设有检测线和质控线， 所述检测线上包被捕获探针； 所述质控线上包被牛血清白蛋白偶 联的生物素。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述捕获探针的工作浓度为20～ 50nM， 所述捕获探针利用含有0.6～1.0M  KCl的PBS溶液作为稀释缓冲液； 所述牛血清白蛋 白偶联的生物素的工作浓度为0.1 ‑0.5mg/mL。 4.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的玻璃纤维样品垫的制备方法为， 将宽18～22mm的玻璃 纤维样品垫浸入反应缓冲液中4.5～5.5min完成饱和， 然后在45～55 ℃下干燥20～3 0h。 5.根据权利要求2所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述样品垫与硝酸纤维素膜重叠部位长 度为2‑4mm， 样品垫置于硝酸纤维素膜上方； 吸水纸与硝酸纤维素膜间重叠部位长度为2 ‑ 4mm， 吸水纸置 于硝酸纤维素膜上 方。 6.根据权利 要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测线和质控线之间相距4 ‑6mm； 所 述试纸条的宽度为3 ‑5mm， 所述检测线距离样品垫4 ‑6mm， 质控线距离吸水纸 4‑6mm。 7.一种基于时间分辨荧光微球的检测沙门氏菌及耐药沙门氏菌的方法， 其特征在于， 所述方法为采用权利要求 1～6任一所述的无扩增时间分辨层析定量试剂盒进 行检测， 具体 步骤如下： (1)将链霉亲和素修饰的时间分辨荧光微球和5 ’端经生物素修饰的核酸探针进行偶联 获得荧光探针； (2)提取待测样本的DNA； (3)将步骤(1)的荧光探针、 步骤(2)的DNA、 Cas12a核酸酶和crRNA室温静置10～30min 获得混合液； (4)将步骤(3)的混合液滴加到样品垫上， 孵育， 使用免疫定量分析仪并结合标准曲线 进行定量。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述偶联的条件为20～27℃下 偶联10～20min， 所述链霉亲和素修饰的时间分辨荧光微球的终浓度为1～10ng/mL， 5 ’端经 生物素修饰的核酸探针的终浓度为10～80nM 。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述方法在pH6.5～7.5的条件下进行反 应。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述标准曲线的制备方法为针对含有不 同浓度的沙门氏菌或耐药菌株的阴性溶液进行核酸提取获得DNA， 将链霉亲和素修饰的时权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807397 A 2间分辨荧光微球和5 ’端经生物素修饰的核酸探针混合获得荧光探针， 将荧光探针、 DNA、 Cas12a核酸酶和crRNA室温静置10～30min后滴加到样品垫上， 孵育， 使用免疫定量分析仪 进行定量分析， 将数据进行拟合得到标准曲线。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807397 A 3