(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210495096.8 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 张敬泽　商庆华　 (74)专利代理 机构 杭州合信专利代理事务所 (普通合伙) 33337 专利代理师 黄平英 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种蔬菜菌核病的早期分子快速检测方法 及其应用 (57)摘要 本发明公开一种蔬菜菌核病的早期分子快 速检测方法及其应用， 其中用于快速检测的引物 组合包括用于鉴定核盘菌的专化性引物对和用 于鉴定小核盘菌的专化性引物对； 其中鉴定核盘 菌的专化性引物对为Ss ‑F/Ss‑R(SEQ ID NO:1/ SEQ ID NO:2)， 扩增产物约400bp； 鉴定小核盘菌 的专化性引物对为Sm ‑F/Sm‑R(SEQ ID NO:3/SEQ   ID NO:4)， 扩增产物约600bp。 采用本发明方法， 无需经过病原菌的分离、 培养， 可 以对真菌基因 组DNA或田间样本DNA进行PCR扩增检测， 扩增效 率高， 特异性好， 能快速检测、 鉴定引起蔬菜菌核 病的核盘菌和小核盘菌； 为蔬菜菌核病的综合防 治提供依据。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 115044696 A 2022.09.13 CN 115044696 A 1.一种快速检测核盘菌和小核盘菌的引物组合， 其特征在于， 包括用于鉴定核盘菌 (Scleroti nia scleroti orum)的专化 性引物对： Ss‑F(SEQ ID NO:1):5’GCATGGGATATCCTCAATC 3’； Ss‑R(SEQ ID NO:2):5’ATGGACGAGTGC CCGCTCTA 3’； 以及用于鉴定小 核盘菌(Scleroti nia minor)的专化 性引物对： Sm‑F(SEQ ID NO:3):5’TTCACTACCTAGTCTAGTAC ‑3’； Sm‑R(SEQ ID NO:4):5’TTGGAAGAGAGATAG GAGGG 3’。 2.如权利要求1所述的引物组合在快速检测核盘菌和/或小 核盘菌中的用途。 3.如权利要求1所述的引物组合在早期快速检测蔬菜菌核病中的用途。 4.根据权利要求3所述的用途， 其特 征在于， 所述蔬菜为 生菜、 莴苣或油菜。 5.根据权利要求3所述的用途， 其特征在于， 所述菌核病由核盘菌和/或小核盘菌侵染 引起。 6.一种快速检测核盘菌和/或小核盘菌的试剂 或试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求 1所述的引物组合。 7.一种快速检测核盘菌和小 核盘菌的方法， 其特 征在于， 包括： 以待测样品基因 组DNA为模板， 使用如权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增； 根据扩增产物的片段 大小判断待测样品是否受核盘菌和/或小 核盘菌侵染。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品来自蔬菜叶片组织、 蔬菜茎 段、 土壤或病原菌DNA。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的体系为： 2   ×HieffTMPCR  Master Mix(With  Dye)， 12.5 μl； ddH2O， 8 μl； 引物Ss ‑F， 0.5 μl； 引物Sm ‑F， 0.5 μl； 引物Ss ‑R， 0.5μl； 引物Sm ‑R， 0.5μl； DNA模板， 2.5μl； PCR扩增程序为： 95℃3min； 95℃30sec， 56℃ 30sec， 72℃3 0sec， 35个循环； 72℃10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044696 A 2一种蔬菜菌核病的早期分子快速检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及DNA分子检测技术领域， 尤其是涉及核盘菌和小核盘菌的检测方法及 其应用于蔬菜菌核病的早期检测、 预防和控制等 技术领域。 背景技术 [0002]菌核病是由能产生菌核的病原菌所引起的一类世界性真菌病害。 这些病原菌包括 子囊菌门的核盘菌属(Sclerotinia)、 葡萄孢属(Botrytis)和担子菌门的丝核菌属 (Rhizocto nia)以及小 核菌属(Sclerotium)真菌等。 [0003]引起蔬菜菌核病的主要病原菌是核盘菌属的核盘菌 (Sclerotinia   sclerotiorum)和小核盘菌(Sclerotinia  minor)。 其中核盘菌 所引起的菌核病在世界范围 内广泛发生， 其能够侵染全世界包括75个科、 278属共400余种植物， 包括许多重要的农作 物， 多数为双子叶植物， 如青菜、 莴苣及生菜在内的多种蔬菜； 小核盘菌的寄主范围也十分 广泛， 据统计其能侵染 100多种植物。 [0004]核盘菌和小核盘菌侵染寄主时， 寄主表面产生褐色病斑， 进而造成严重的组织降 解， 呈软腐状。 大部分被侵染的寄主， 侵染初期常表现为叶片或幼茎组织表面形成褐色病 斑， 随后病斑慢慢扩大， 形成水浸状软腐； 除侵染 叶片和幼茎组织外， 核盘菌和小核盘菌还 会侵染寄主的茎秆或嫩枝， 随着病斑的发展， 感病茎秆部 分形成环状病斑， 导致末端叶片变 黄， 继而变为褐色， 直至植物整株死 亡。 [0005]虽然两种病原菌是同属的病原菌， 但两种病原菌侵染寄主的方式不同。 核盘菌的 初侵染源主要是菌核萌发形成子囊盘， 释放子囊孢子。 子囊孢子从子囊盘的子囊中强烈地 弹射出后， 被风传到整个田块或相 邻的田块中， 侵染地上部分植物。 小核盘菌主要由菌核 萌 发产生菌丝体， 以菌丝体形式侵染寄主。 由于两个病原菌生物学特性和侵染寄主的差异， 因 而在病害防治策略上也是不同的。 但两个病原菌在侵染寄主初期， 寄主表现的症状十分相 似， 这给病害防治策略的选择造成了困难。 [0006]目前， 蔬菜菌核病病原菌 的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定， 主要包 括田间症状观察、 病原菌分离、 菌核及分子鉴定等。 这些方法耗时较长， 极不适合于蔬菜菌 核病的早期诊断。 另外， 菌核病是由两个病原菌引起的， 迄今没有同时检测两个病原菌的技 术。 为了有效防治病害， 生产上迫切需要提供早期病害诊断信息。 因此， 开 发准确、 快速的病 害早期诊断技 术， 对菌核病有效防控具有重要意 义。 发明内容 [0007]针对现有技术存在的上述问题， 本发明所要解决的技术问题在于提供用于快速检 测核盘菌和小核盘菌的专化性检测引物和检测方法。 可用于蔬菜菌核病(叶片， 茎段和土壤 中)的检测， 对蔬菜菌核病病害的早期快速检测、 土壤病菌群体 分布及病害的防治 具有重要 意义。 [0008]一种快速检测核盘菌和小核盘菌的引物组合， 包括用于鉴定核盘菌(Sclerotinia  说　明　书 1/7 页 3 CN 115044696 A 3