(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210489635.7 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市大 学 东路174号 (72)发明人 廖惠红　王茜　刘福平　黄宏明　 黄其椿　汪妮娜　陈东奎　徐宁　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 李小伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种柑橘黄龙病高通 量KASP检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 公开了一种 柑橘黄龙病高通量KASP检测方法， 包括： 生物信 息学查询与引物设计； 高通量DNA提取方法工艺 流程建立； 引物初步筛选； KASP引物对筛选； KASP 体系条件优化。 本发明采用样品总基因组 高通量 提取工艺实验得到的改良CTAB法提取黄龙病检 测样本48份， 并且用进行国标法黄龙病普通PCR 法检测样品的黄龙病感染阴阳性； 将提取好的总 基因组转移至384孔板中， 每个样品转移4个孔； 按照引物对采用C11a+B7a， 引物比例和加入量以 及优化后的扩增程序进行验证， 得到的分型结果 与国标普通PCR法比较， 计算分型的准确度， 所有 实验数据真实、 可靠， 符合要求。 权利要求书6页 说明书24页 序列表7页 附图26页 CN 114891906 A 2022.08.12 CN 114891906 A 1.一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法， 其特征在于， 所述柑橘黄龙病高通量KASP检 测方法采用内参引物和黄龙病检测引物共同检测的双引物法， 信号值在靠近Y轴的群体为 检测阴性， 由Y轴向象限中部的靠近的群体为黄龙病阳性群体； 所述柑橘黄龙病高通量KASP 检测方法包括生物信息学查询与引物设计； 高通量DNA 提取方法工艺流程建立； 引物初步筛 选； KASP引物对筛 选； KASP体系条件 优化； 其中， 所述黄龙病样品总基因组提取工艺改良CTAB提取法为按照0.1～0.2g研磨样品 粉末加入1mL的CTAB裂解液在65℃中水浴1h后离心上清采取磁珠法提取， 大量样品提取采 用96孔深孔板结合高通 量核酸提取仪完成； 所述内参引物选取柑橘扩增引物Forward： TTAGGAACAACAACAGGCACGA， Reverse： AGAAAATAATACCACAGTTCAGCCA； 黄龙病检测引物扩增引物序列为Forward： GAACAACTTGAGTCTGTGGCGT， Reverse： GGTATTCGAGCTGGTATCATAAGTG； 其中内参Forward   primers合成过程添加HE X荧光接头序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT； 黄 龙病Forward  primers 合成过程添加FAM荧 光接头序列GA AGGTGACCAAGTTCATGCT； 所述优化后的黄龙病KAS P检测体系As sy mix配制为： 黄龙病检测引物： FAM引物： 下游引物： d dH2O＝6 μL： 3 0 μL： 64 μL； 内参检测引物： H EX引物： 下游引物： d dH2O＝12 μL： 3 0 μL： 58 μL； Assay mix配制为黄龙病检测引物： 内参引物＝8： 1， 并按照1/35的比例加入2 × MasterMix中； 所述优化后的黄龙病KASP检测体系的扩增程序为： 阶段1： 94℃预变性15min； 阶段2： 94 ℃20s， 63～5 7℃， 每个循环降0.6℃， 1min， 共循环10次； 阶段3： 94℃20s， 57℃40sec， 共循环 20次， 信号采集； 阶段4： 94℃20s， 57℃40sec， 共循环3次； 如果分群不明显， 重复阶段4两至 三次。 2.如权利要求1所述的柑橘黄龙病高通量KASP检测方法， 其特征在于， 所述柑橘黄龙病 高通量KASP检测方法包括以下步骤： 步骤一， 进行引物设计和初筛： 分析柑橘黄龙病病原菌与柑橘类序列相关信息， 分别设 计5～10对内参标准引物和黄龙病病原菌检测引物， 并对设计的内参引物和黄龙病检测引 物用PCR方法进行初步筛 选； 步骤二， 进行黄龙病检测样本总基因组提取； 对样品进行核酸提取体系确定， 并按照国 标检测方法进 行检测提取样品DNA的准确性； 根据核酸提取体系确定的结果， 在自动核酸提 取仪上进行样品的核酸 提取， 并将提取基因 组使用黄龙病国标PCR检测方法进行检测； 步骤三， 进行KASP引物对筛选： 将段筛选出来的特异性好的内参引物和黄龙病引物进 行配对组合， 在LGC系统上进行初步筛 选， 选择分型较好的3～5对引物对进行 条件优化； 步骤四， 进行KASP体系条件优化： 进行引物对配比、 反应程序和反应体系其他成分优 化， 并根据分型效果和分型准确性进行筛选最优的一对引物组合进行后续的大量样本检 测。 3.如权利要求2所述的柑橘黄龙病高通量KASP检测方法， 其特征在于， 所述步骤一中的 引物筛选包括四轮， 其中所述第一轮筛选的内参引物包括Citrus ‑P1、 Citrus ‑P2、 Citrus ‑ P3、 Citrus‑P4、 Citrus‑P5、 Citrus‑P6、 Citrus‑P7、 Citrus‑P8、 Citrus‑P9； 其中， 所述引物Citrus ‑P1的序列为SEQ  ID NO： 1， 所述引物Citrus ‑P2的序列为SEQ  ID 权　利　要　求　书 1/6 页 2 CN 114891906 A 2NO： 2， 引物Citrus ‑P3的序列为SEQ  ID NO： 3， 引物Citrus ‑P4的序列为SEQ  ID NO： 4， 引物 Citrus‑P5的序列为SEQ  ID NO： 5， 引物 Citrus‑P6的序列为SEQ  ID NO： 6， 引物Citrus ‑P7的 序列为SEQ  ID NO： 7， 引物Citrus ‑P8的序列为SEQ  ID NO： 8， 引物Citrus ‑P9的序列为SEQ   ID NO： 9； 所述黄龙病引物包括HLB ‑P1、 HLB‑P2、 HLB‑P3、 HLB‑P4、 HLB‑P5、 HLB‑P6、 HLB‑P7、 HLB‑ P8、 HLB‑P9、 HLB‑P10； 其中， 所述引物HLB ‑P1的序列为SEQ  ID NO： 10， 所述引物HLB ‑P2的序列为SEQ  ID NO： 11， 所述引物 HLB‑P3的序列为SEQ  ID NO： 12， 所述引物HLB ‑P4的序列为SEQ  ID NO： 13， 所述 引物HLB‑P5的序列为SEQ  ID NO： 14， 所述引物HLB ‑P6的序列为SEQ  ID NO： 15， 所述引物 HLB‑P7的序列为SEQ  ID NO： 16， 所述引物HLB ‑P8的序列 为SEQ ID NO： 17， 所述引物HLB ‑P9 的序列为SEQ  ID NO： 18， 所述引物HLB ‑P10的序列为SEQ  ID NO： 19； 所述第一轮引物筛 选包括： 挑选3个黄龙病检测阳性样本， 和3个阴性样本作为模板进行内参引物筛选； 挑选4个黄 龙病检测阳性样本， 和2个阴性样本作为模板进 行黄龙病引物筛选； DNA样 本10倍稀释使用； PCR体系包括： 5μL  2×Taq mix， 0.5μL  Primer F， 0.5μL Primer R， 1μL模板DNA， 3μL   ddH2O， 共计10 μL； 按照以下程序进行PCR扩增： PCR扩增程序： 94℃5min； 90℃30sec， 63℃30sec， 72℃ 45sec， 每个循环退火温度降低0.6℃， 共10个循环； 94℃30sec， 5 7℃45sec， 72℃45sec， 共27 个循环； 72℃5mi n； 扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳 。 4.如权利要求3所述的柑橘黄龙病高通量KASP检测方法， 其特征在于， 所述第二轮引物 筛选包括： 引物： Cit rus‑P1， Citrus‑P3， Citrus‑P4， Citrus‑P5， Citrus‑P7， Citrus‑P8； HLB‑P3， HLB‑P6， HLB‑P7， HLB‑P8， HLB‑P9， HLB‑P10； 条件变动： 1、 DNA稀释比例为1:10和引物浓度为0.1mM； 2、 DNA稀释比例为1:10 0和引物浓度为0.5mM； PCR体系1包括： 5 μL  2×Taq mix， 0.1 μL  Primer F， 0.1 μL Primer R， 1 μL模板DNA， 3.8 μ L ddH2O， 共计10 μL； PCR体系2包括： 5 μL  2×Taq mix， 0.5 μL  Primer F， 0.5 μL Primer R， 1μL模板DNA， 3 μL   ddH2O， 共计10 μL； 按照以下程序进行PCR扩增： PCR扩增程序： 94℃5min； 90℃30sec， 63℃30sec， 72℃ 40sec， 每个循环退火温度降低0.6℃， 共10个循环； 94℃30sec， 5 7℃30sec， 72℃45sec， 共27