(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210492072.7 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 分子标记 （武汉） 生物育种有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区光谷大道58号1栋H0194(自贸区 武汉片区)(一址多照) (72)发明人 张毅　张倩　张娟　 (74)专利代理 机构 武汉仁合利泰专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 42275 专利代理师 黄昀 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种西瓜全基因组SNP-Panel的开发、 检测 方法及育种应用 (57)摘要 本发明涉及一种西瓜全基因组SNP ‑Panel的 开发、 检测方法及育种应用， 包获取需检测的西 瓜DNA样品， 基于西瓜基因组重测序信息开发覆 盖西瓜整个基因组的SNP标记56245个SNP； 优化 精选722个SNP； 每个SNP位点包含两个不同碱基 变异位点； 针对每一个SNP标记设计一对相对应 的特异扩增引物； 将722个SNP标记进行组合， 构 成一个基因Panel； 使用特异引物扩增目标SNP标 记位点， 然后添加测序接头， 完成二代测序文库 的构建； 质控与定量； 在illumina测序仪上完成 PE150测序获得序列数据； 获取所标记 的各位点 的基因型。 利用该技术可实现分子育种领域的基 因检测及分析需求， 检测覆盖度广， 分析速度快， 检测成本低， 大幅度提高我国西瓜育种效率， 缩 短育种周期， 促进农业发展。 权利要求书2页 说明书21页 附图1页 CN 115011717 A 2022.09.06 CN 115011717 A 1.一种西瓜全基因 组SNP‑Panel的开发、 检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)获取需检测的西瓜DNA样品， 包括提取干种子、 幼嫩茎段、 叶片、 幼穗老叶、 发芽幼苗 中的DNA； (2)基于西瓜 基因组重测序信息开发覆盖西瓜整个 基因组的SNP标记5 6245个SNP； (4)基于步骤(2)全基因 组覆盖优化精选72 2个SNP； (5)设计722个SNP标记， 每个SNP位点包含两个不 同碱基变异位点， 用于检测该位点的 等位基因变化； (6)针对每一个SNP标记设计一对相对应的特异扩增引物； (7)将722个SNP标记进行组合， 构成一个 基因Panel； (8)使用步骤(6)中的特异引物扩增目标SNP标记位点， 然后添加测序接头， 完成二代测 序文库的构建； (9)质控与定量， 包括采用实时荧 光定量PCR和Agi lent 2100； (10)在illumina测序仪上完成PE15 0测序获得序列数据； (11)通过自动化分析 数据， 获取 所标记的各位 点的基因型。 2.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (2)中SNP位点的物理位置 是基于西瓜品种Citru llus lanatus subsp.vu lgaris cv.97103 的全基因 组序列比对结果确定的。 3.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 所述 西瓜品种Citrullus  lanatus subsp.vulgaris  cv.97103的全基因组序列的版本号为 Watermel on(97103)v2。 4.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (4)中722个SNP标记在染色体上的分布如下： Chr01染色体71个SNPs； Chr02染色体75个 SNPs； Chr03染色体65个SNPs； Chr04染色体49个SNPs； Chr05染色体76个SNP s； Chr06染色体 64个SNPs； Chr07染色体65个SNP s； Chr08染色体57个SNP s； Chr09染色体76个SNPs； Chr10染 色体65个SNPs； C hr11染色体59个SNPs； 平均每条染色体6 5.66个SNPs； 标记密度5 04.43Kb。 5.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (4)中722个SNP标记包括目标性状 基因和一套 背景选择 标记。 6.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (6)针对每一个SNP标记设计一对相应的特殊的特异 性引物， 为每一个SNP标记仅对应1个正 向引物和一个反向引物， 且所有72 2个SNP的所有引物间无重复。 7.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (4)所述72 2个SNP标记可以依据育种的个性 化需求自由组合、 选择。 8.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于： 步骤 (7)所述构成基因Panel的72 2个SNP序列为 ID号Cla970 01至Cla97722的primer。 9.根据权利要求1所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的开发、 检测方法， 其特征在于， 所述 检测的特 征在于可以同时检测10 000个DNA样品。 10.根据权利要求1 ‑9任一项所述的西瓜全基因组SNP ‑Panel的应用， 其特征在于， 可用 于以下任一种育种应用或育种应用组合： (1)在西瓜育种过程中鉴定各项指标的表型中的应用；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115011717 A 2(2)在西瓜种质资源鉴定、 改良或分子标记辅助育种、 全基因组关联分析、 QTL分析、 物 种进化分析中的应用； (3)在西瓜分子设计育种、 标记辅助的主效基因选择、 回交育种及其背景选择、 分子辅 助育种、 全基因组育种、 种子纯度检测、 转基因成份鉴定中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115011717 A 3