(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210484565.6 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 胡长敏　李政志　郭爱珍　陈颖钰　 陈曦　陈建国　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01)C12R 1/46(2006.01) C12R 1/35(2006.01) C12R 1/44(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探 针组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测多种牛乳腺炎病原 的引物对和探针组合， 所述引物对和探针分别针 对金黄色葡萄球菌rpoB基因、 链 球菌tuf基因、 牛 支原体oppD/F基因、 产色葡萄球菌sodA基因、 大 肠杆菌79号基因， 序列如SEQ  ID NO:1‑15所示。 本发明公开的引物对和探针组合能够对临床奶 样或其它样本中的金黄色葡萄球菌、 链球菌(无 乳链球菌、 停乳链球菌、 乳房链球菌)、 牛支原 体、 产色葡萄球菌、 大肠杆菌同时进行检测， 不仅能 提高检测效率， 而且还具有较高的灵敏度和特异 性。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图4页 CN 114657273 A 2022.06.24 CN 114657273 A 1.一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合， 其特征在于： 所述多种牛乳腺炎 病原是金黄 色葡萄球菌、 链球菌、 牛支原体、 产色葡萄球菌、 大肠杆菌， 所述引物对和探针分 别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、 链球菌tuf基因、 牛支原体oppD/F基因、 产色葡萄球菌 sodA基因、 大肠杆菌79号基因， 其中， 针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的引物对序列如SEQ  ID NO:1‑2所示， 探针序列如SEQ   ID NO:3所示； 针对链球菌tuf基因的引物对序列如SEQ  ID NO:4‑5所示， 探针序列如SEQ  ID NO:6所 示； 针对牛支原体oppD/F基因的引物对序列如SEQ  ID NO:7‑8所示， 探针序列如SEQ  ID  NO:9所示； 针对产色葡萄球菌sodA基因的引物对序列如SEQ  ID NO:10‑11所示， 探针序列如SEQ   ID NO:12所示； 针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如SEQ  ID NO:13‑14所示， 探针序列如SEQ  ID  NO:15所示。 2.如权利要求1所述的引物对和探针组合， 其特征在于： 所述探针的5 ′端标记报告基 团， 3′端标记猝灭基团。 3.如权利要求2所述的引物对和探针组合， 其特征在于： 针对金黄色葡萄球菌rpoB基因 的探针5′端标记的报告基团是 FAM， 3′端标记的猝灭基团是BHQ1； 针对链球菌tuf基因的探针5 ′端标记的报告基团是VIC， 3 ′端标记的猝灭基团是BHQ1； 针对牛支原体oppD/F基因的探针5 ′端标记的报告基团是CY5， 3 ′端标记的猝灭基团是 BHQ2； 针对产色葡萄球菌sodA基因的探针5 ′端标记的报告基团是Texas  red， 3′端标记的猝 灭基团是BHQ2； 针对大肠杆菌79号基因的探针5 ′端标记的报告基团是CY5.5， 3 ′端标记的猝灭基团是 BHQ3。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物对和探针组合在非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原 中的应用， 所述多种牛乳 腺炎病原是金黄 色葡萄球菌、 链球菌、 牛支原体、 产色葡萄球菌、 大 肠杆菌。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述链球菌是无乳链球菌、 停乳链球菌、 乳房 链球菌。 6.一种检测多种牛乳腺炎病原的试剂 盒， 其特征在于： 该试剂 盒包含权利要求1 ‑3任一 项所述的引物对和探针组合。 7.一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法， 其特征在 于： 该方法包括以检测样品为模板， 加入反应液、 超纯水和权利要求1 ‑3任一项所述的引物 对和探针组合并进行PCR扩增的步骤。 8.如权利 要求7所述的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法， 其特征 在于， 所述PCR扩增体系为： 2 ×Probe PCR Master Mix 10 μL； 针对金黄色葡萄球菌rpoB基 因的上下游引物终浓度均为450nmol/L、 探针终浓度为175nmol/L； 针对链球菌tuf基因的上 下游引物终浓度均为450nmol/L、 探针终浓度为125nmol/L； 针对牛支原体oppD/F基因的上权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114657273 A 2下游引物终浓度均为400nmol/L、 探针终浓度为175nmol/L； 针对产色葡萄球菌sodA基因的 上下游引物终浓度均为400nmol/L、 探针终浓度为125nmol/L； 针对大肠杆菌79号基因的上 下游引物终浓度均为 400nnol/L、 探针终浓度为20 0nmol/L； 模板 5 μL， ddH2O补足至20 μL。 9.如权利 要求7所述的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法， 其特征 在于， 所述PCR扩增程序为， 37℃污染消化2min； 95℃预变性30s， 1个循环； 95℃10s， 56.7℃ 退火30s， 40个循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114657273 A 3