(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210483350.2 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 山东康华生物医疗科技股份有限公 司 地址 261023 山 东省潍坊市经济开发区月 河路699号 申请人 青岛汉唐生物科技有限公司 (72)发明人 杨帆　陈秀岚　王含　田永帅　 刘嘉男　于明明　刘万建　左雪梅　 宋金铃　 (74)专利代理 机构 潍坊盛润知识产权代理事务 所(普通合伙) 37299 专利代理师 李光林 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针 组合物、 试剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明提供检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒 的引物探针组合物、 试剂盒及其制备方法， 所述 引物探针组合物包括用于检测猫疱疹病毒I型的 引物、 用于检测猫杯状病毒的引物、 用于监测反 应体系内抑制情况的引物、 用于检测猫疱疹病毒 I型的探针、 用于检测猫杯状病毒的探针、 用于监 测反应体系内抑制情况的探针。 采用本发明可同 时检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒， 并且特异性 强、 敏感性高、 快速、 安全。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114940989 A 2022.08.26 CN 114940989 A 1.检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物， 其特征在于： 所述引物探针组合 物包括用于检测猫疱疹病毒I型的引物、 用于检测猫杯 状病毒的引物、 用于监测反应体系内 抑制情况 的引物、 用于检测猫疱疹病毒I型的探针、 用于检测猫杯状病毒的探针、 用于监测 反应体系内抑制情况的探针； 所述用于检测猫疱疹病毒I型的引物具有如SEQ  ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的核苷 酸序列， 或具有与SEQ  ID NO .1和/或SEQ  ID NO .2至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用 于检测猫杯状病毒的引物具有如SEQ  ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的核苷酸序列， 或具有 与SEQ ID NO .3和/或SEQ  ID NO .4至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用于监测反应体系 内抑制情况的引物， 具有如SEQ  ID NO .5和SEQ ID NO .6所示的核苷酸序列； 所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针具有如SEQ  ID NO .7所示的核苷酸序列， 或具有 与SEQ ID NO .7至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用于检测猫杯状病毒的探针具有如SEQ   ID NO .8所示的核苷酸序列， 或具有与SEQ  ID NO .8至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用 于监测反应 体系内抑制情况的探针具有如SEQ  ID NO .9所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物， 其特征在 于： 所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针、 用于检测猫杯 状病毒的探针的两端均分别连接有 荧光报告基团和荧光淬灭基团； 所述荧光报告基团为FAM或ROX或V IC； 所述荧光淬灭基团为 BHQ1或BHQ2。 3.根据权利要求2所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针组合物， 其特征在 于： 所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针： 荧光淬灭基团为BHQ1， 荧光报告基团为FAM； 所述 用于检测猫杯状病毒的探针： 荧 光淬灭基团为BHQ2， 荧 光报告基团为ROX。 4.检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括PCR反应液、 阳性对照品、 阴性对照品和外标对照品； 所述PCR反应液包括具有如SEQ  ID NO .1‑SEQ ID  NO .9所示核苷 酸序列的引物探针组合、 buffer和酶； 所述阳性对照品包括含有猫疱疹病毒 I型的质粒、 含有猫杯状病毒的质粒， 浓度比为1:1； 所述阴性对照品为灭菌去离子水； 所述 外标对照品包 含拟南芥SUC2基因的质粒。 5.检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法， 其特征在于： 包括设计引物探 针、 阳性对照品的制备、 阴性对照品的制备、 外标对照品的制备、 荧光定量RT ‑PCR反应体系 的构建； 所述 设计引物探针： 设计如SEQ  ID NO .1‑SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物和 探针； 所述阳性对照品的制备： 将猫疱疹病毒I型和 猫杯状病毒按照1:1的浓度比例混合制 备成阳性质粒混合液， 阳性质粒混合液中， 含有猫疱疹病毒I型的质粒、 含有猫杯状病毒的 质粒浓度分别为2 ×106拷贝/mL。 6.根据权利要求5所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法， 其特征 在于： 所述外标对照品的制备： 将 拟南芥SUC2基因连接 到质粒载体上， 得到质粒 溶液。 7.根据权利要求5所述的检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的试剂盒的制备方法， 其特征 在于： 所述荧光定量RT ‑PCR反应程序的构建： 50℃逆转录10min， 循环1次； 95℃预变性5min， 循环1次； 94℃变性15s， 6 0℃退火3 0s， 循环40次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114940989 A 2检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒 的引物探针组合物、 试剂盒及 其制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测技术领域， 尤其是涉及检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物 探针组合物、 试剂盒及其制备 方法。 背景技术 [0002]猫疱疹病毒I型(Feline  herpesvirus  type1， FHV1)属于大型的病毒(100～130nm 直径)， 为疱疹病毒科中的甲型疱疹病毒亚科、 水痘属； 感染病毒后常患猫病毒性鼻气管炎 （简称猫鼻支） ， 是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一， 该病上呼吸道症状表现明显， 主要 表现为咳嗽、 打喷嚏、 眼睛、 鼻子分泌物增多、 结膜炎、 角膜炎等。 [0003]猫杯状病毒(Feline  Calicivirus， FCV)为无囊膜的单股正链RNA病毒， 是猫杯状 病毒科、 杯 状病毒属的一员， 猫杯 状病毒感染是猫病毒性呼吸道传染病， 主要表现为上呼吸 道症状， 即精神沉郁、 浆液性和粘液性鼻漏、 结膜炎、 口腔炎、 气管炎、 支气管炎， 伴有双相 热； 是猫的多发病， 发病率高， 死 亡率低。 [0004]猫杯状病毒与猫疱疹病毒I型引发的猫传染性鼻气管炎 的症状类似， 很难根据症 状来分辨出患病猫是被什么感染， 且临床上双重感染的情况也很 常见， 因此建立快速、 准确 的联合检测FHV1和FCV的方法至关重要。 [0005]现有技术中的检测试剂盒， 对FHV1和FCV的检测采用单通道荧光PCR方法或者荧光 PCR所具有的敏感性低、 反应时间长 。 发明内容 [0006]为了克服上述现有技术的缺陷， 本发明提供检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物 探针组合物、 试剂盒及其制备方法， 并达到以下发明目的： 可以同时检测猫疱疹病毒I型和 猫杯状病毒， 提高检测敏感性， 缩短反应时间。 [0007]本发明采用的技 术方案： 检测猫疱疹病毒和猫杯状病毒的引物探针 组合物， 所述引物探针 组合物包括用于 检测猫疱疹病毒I型的引物、 用于检测猫杯 状病毒的引物、 用于监测反应体系内抑制情况的 引物、 用于检测猫疱疹病毒I型的探针、 用于检测猫杯状病毒的探针、 用于监测反应体系内 抑制情况的探针； 所述用于检测猫疱疹病毒I型的引物具有如SEQ  ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的 核苷酸序列， 或具有与SEQ  ID NO .1和/或SEQ  ID NO .2至少85%同一性的核苷酸序列； 所 述用于检测猫杯状病毒的引物具有如SEQ  ID NO .3和SEQ ID NO .4所示的核苷酸序列， 或 具有与SEQ  ID NO .3和/或SEQ  ID NO .4至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用于监测反应 体系内抑制情况的引物， 具有如SEQ  ID NO .5和SEQ ID NO .6所示的核苷酸序列； 所述用于检测猫疱疹病毒I型的探针具有如SEQ  ID NO .7所示的核苷酸序列， 或 具有与SEQ  ID NO .7至少85%同一性的核苷酸序列； 所述用于检测猫杯状病毒的探针具有说　明　书 1/7 页 3 CN 114940989 A 3