(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210486024.7 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 地址 210046 江苏省南京市南京经济技 术 开发区科创路红枫 科技园C1-2栋东段 1-6层 (72)发明人 聂俊伟　瞿志鹏　曹林　张宇　 朱涵雪　 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种MGI平台转 座酶双端标签文库的制备 (57)摘要 本发明提供一种制备与非转座式双标签滚 环测序文库兼容的转座式双标签滚环测序文库 的方法， 及其中使用的试剂， 特别是一种寡核苷 酸对。 权利要求书3页 说明书13页 序列表10页 附图3页 CN 114836415 A 2022.08.02 CN 114836415 A 1.一种寡核苷酸对， 其包 含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸， 其中： 第一寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包含第一双端文库夹板序列、 第一标签序列、 修饰的 单端文库夹板全序列和第一衔接序列， 第二寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包含第二双端文库夹板序列、 第 二标签序列和第二衔 接序列， 第一双端文库夹板序列和第二双端文库夹板序列构成双端文库夹板全序列， 任选地， 第一双端文库夹板序列是双端文库夹板全序列的3 ’部分， 第二双 端文库夹板序列是双端文 库夹板全序列的5 ’部分， 进一步任选地， 双端文库夹板全序列是5 ’ ‑CTGATAAGGTCGCCATGCC TCTCAGTACGTCAGCAGTT ‑3’(SEQ ID NO： 6)所示序列， 进 一步任选地， 第一双端文库夹板序列 是5’ ‑CTCTCAGTACGTCAGCAGTT ‑3’(SEQ ID NO： 7)所示序列， 第二双端文库夹板序列是5 ’ ‑ GCATGGCGACCTTATCAG‑3’(SEQ ID NO： 8)所示序列， 任选地， 第一标签序列和/或第二标签序列独立是1 ‑20个连续任意核苷酸， 例如4 ‑16个 连续任意核苷酸， 例如4、 6、 8、 10、 12或16个连续任意核苷酸， 任选地， 单端文库夹板全序列是5 ’ ‑CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACAT GGCTACGATCCGACTT ‑ 3’(SEQ ID NO： 9)所示序列， 任选地， 修饰的单端文库夹板全序列中的修饰包含3 ’端核苷酸 缺失或替代， 例如1 ‑37个， 例如1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36或37个， 特别是13个核苷酸的缺失 或替代， 和/或， 修饰的单端文库夹板全序列中的修饰包含5 ’端核苷酸缺失或替代， 例如1 ‑5 个， 例如1、 2、 3、 4或5个核苷酸的缺失或替代， 和/或， 修饰的单端文库夹板全序列中的修饰 包括5’端添加GAAGACAA， 进一步任选地， 修饰的单端文库夹板全序列是5 ’‑ CAACTCCTTGGCTCACAGA ACGACATG GC‑3’(SEQ ID NO： 11)所示序列， 第一衔接序列与第三寡核苷酸的3 ’端部分互补， 第二衔接序列与第四寡核苷酸的3 ’端 部分互补， 或者， 第一衔接序列与第四寡核苷 酸的3’端部分互补， 第二衔接序列与第三寡核 苷酸的3’端部分互补， 第三寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包含第一转座酶识别序列和第一转座引物结合序列， 第四寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包 含第二转座酶识别序列和第二 转座引物结合序列， 任选地， 第 一转座酶识别序列和第 二转座酶识别序列相同， 进一步任选地， 第 一转座酶 识别序列和第二 转座酶识别序列是5 ’ ‑CTGTCTCT TATACACATCT ‑3’(SEQ ID NO： 1)所示序列； 任选地， 第 一转座引物结合序列和第 二转座引物结合序列不同， 进一步任选地， 第一转 座引物结合序列 是5’ ‑TCGTCGGCAGCGTC ‑3’(SEQ ID NO： 2)所示序列的反向互补序列， 第 二 转座引物结合序列是5 ’ ‑GTCTCGTG GGCTCGG‑3’(SEQ ID NO： 3)所示序列的反向互补序列， 进一步任选地， 第一衔接序列与第三寡核苷酸的第一转座引物结合序列互补， 第二衔 接序列与第四寡核苷酸的第二转座引物结合序列 互补， 或者， 第一衔接序列与第四寡核苷 酸的第二转座引物结合序列互补， 第二衔接序列与第三寡核苷酸的第一转座引物结合序列 互补， 任选地， 第 一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸独立为单链、 双链或其组合， 进一步任选地， 第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸独立为正链或负链， 更进一步任选地， 第一寡核苷酸为正 链， 第二寡核苷酸 为正链。 2.根据权利要求1所述的寡核苷酸对， 其中第一寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包含第一权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114836415 A 2双端文库夹板序列、 第一标签序列、 修饰的单端文库夹板全序列和 第一衔接序列， 第二寡核 苷酸自5’端向3’端方向包含第二双端文库夹板序列、 第二标签序列和第二衔接序列， 第一 衔接序列与第三寡核苷酸的第一转座引物结合序列互补， 第二衔接序列与第四寡核苷酸的 第二转座引物结合序列互补， 第一双端文库夹板序列是5 ’ ‑CTCTCAGTACGTCAGCAGTT ‑3’(SEQ ID NO： 7)所示序列， 第 二双端文库夹板序列是5 ’ ‑GCATGGCGACCTTATCAG ‑3’(SEQ ID NO： 8)所示序列， 修饰的单端 文库夹板全序列是5 ’ ‑CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGC ‑3’(SEQ ID NO： 11)所示序列， 第 一转座引物结合序列 是5’ ‑TCGTCGGCAGCGTC ‑3’(SEQ ID NO： 2)所示序列的反向互补序列， 第二转座引物结合序列是5 ’ ‑GTCTCGTGGGCTCGG ‑3’(SEQ ID NO： 3)所示序列的反 向互补序 列。 3.根据权利要求1所述 的寡核苷酸对， 其中第一寡核苷酸是5 ’ ‑CTCTCAGTACGTCAGCAGT TNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTCGTCGGCAGCGTCAGAT ‑3’(SEQ ID NO： 12)所 示序列， 第二寡核苷酸是5 ’ ‑GCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNN GTCTCGTGGGCTCGGAGA ‑3’(SEQ  ID NO： 13)所示序列， N是任意核苷酸。 4.根据权利要求1所述的寡核苷酸对， 其中第一寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包含第一 双端文库夹板序列、 第一标签序列、 修饰的单端文库夹板全序列和 第一衔接序列， 第二寡核 苷酸自5’端向3’端方向包含第二双端文库夹板序列、 第二标签序列和第二衔接序列， 第一 衔接序列与第四寡核苷酸的第二转座引物结合序列互补， 第二衔接序列与第三寡核苷酸的 第一转座引物结合序列互补， 第一双端文库夹板序列是5 ’ ‑CTCTCAGTACGTCAGCAGTT ‑3’(SEQ ID NO： 7)所示序列， 第 二双端文库夹板序列是5 ’ ‑GCATGGCGACCTTATCAG ‑3’(SEQ ID NO： 8)所示序列， 修饰的单端 文库夹板全序列是5 ’ ‑CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGC ‑3’(SEQ ID NO： 11)所示序列， 第 一转座引物结合序列 是5’ ‑TCGTCGGCAGCGTC ‑3’(SEQ ID NO： 2)所示序列的反向互补序列， 第二转座引物结合序列是5 ’ ‑GTCTCGTGGGCTCGG ‑3’(SEQ ID NO： 3)所示序列的反 向互补序 列。 5.根据权利要求1所述 的寡核苷酸对， 其中第一寡核苷酸是5 ’ ‑CTCTCAGTACGTCAGCAGT TNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA GAACGACATGGC  GTCTCGTGGGCTCGGAGA ‑3’(SEQ ID NO： 14) 所示序列， 第二寡核苷酸是5 ’ ‑GCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTCAGAT ‑3’ (SEQ ID NO： 15)所示序列， N是任意核苷酸。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的寡核苷酸对， 其用于制备与MGI平台非转座式双标签 滚环测序文库兼容的转 座式双标签滚环测序文库。 7.一种制备与MGI平台非转座式双标签滚环测序文库兼容的转座式双标签滚环测序文 库的方法， 其包括以下步骤： (1)用转座酶复合物处理含DNA样品， 所述转座酶复合物包含第三寡核苷酸和第四寡核 苷酸， 其中： 第三寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包 含第一转座酶识别序列和第一 转座引物结合序列， 第四寡核苷酸自5 ’端向3’端方向包 含第二转座酶识别序列和第二 转座引物结合序列， 任选地， 第 一转座酶识别序列和第 二转座酶识别序列相同， 进一步任选地， 第 一转座酶 识别