(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210484636.2 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 上官凌飞　王令宇　房经贵　王晨　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 吴爽　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的 引物组及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于葡萄转色肥最佳施 用时期判断的引物组及其应用， 所述引物组包括 如下两对引 物： (1)检测 VvKUP 1基因的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1~2所示； (2)检测 VvKUP2基因的引物对： 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 3~4所示。 本发明以不同地区 ‘夏黑’葡萄根施 硫酸钾实验为基础， 快速、 精确地筛选能够预测 葡萄转色肥最佳施用时期的标记基因， 具有快速 简便、 特异性强、 精准可靠的等优点。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114891913 A 2022.08.12 CN 114891913 A 1.一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组， 其特 征在于， 包括如下两对引物： (1) 检测基因 VvKUP1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1~2所示； (2) 检测基因 VvKUP2的引物对： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3~4所示。 2.一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的检测试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 所述的引物组。 3.权利要求1所述的引物组、 权利要求2所述的试剂 盒在葡萄转色肥最佳施用时期判断 中的应用。 4.一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1) 取葡萄叶片， 提取RNA， 并反转录为cDNA， 以SEQ  ID NO： 1~2、 SEQ ID NO： 3~4为引 物， 荧光定量PCR扩增 VvKUP1基因、VvKUP2基因； (2) 若VvKUP1基因的表达趋势由下降转为上升， VvKUP2基因的表达趋势由下降转为上 升， 根施转色肥。 5.根据权利要求4所述的一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法， 其特征在于， 所述转色肥为硫酸钾。 6.根据权利要求4或5所述的一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法， 其特征在 于， 所述方法适用于葡萄成年 树。 7.根据权利要求6所述的一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法， 其特征在于， 所述方法适用于 ‘夏黑’葡萄品种。 8.一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组的筛 选方法， 包括如下步骤： (1) 葡萄转色肥施肥处理： 在葡萄膨果后4  天、 葡萄膨果后8  天、 葡萄膨果后12  天、 葡 萄膨果后16  天选取发育一致的植株， 在葡萄根部周围20  cm处沟施硫酸钾肥料； 膨果结束 前4天、 膨果结束时、 葡萄膨果后4天、 葡萄膨果后8天、 葡萄膨果后12天、 葡萄膨果后16天喷 施之前采集第8～ 9节位的成熟叶片， 并用液氮处 理， 放﹣80℃冰箱； (2) 样品总RNA提取： 提取步骤(1)中所采样品的总RNA， 并反转录为cDNA； (3) 标记基因初筛： 选择 VvKUP1、 VvKUP2 基因用于生物标记的开发； (4) 标记基因对应的特征表达信号分析： 综合 VvKUP1、 VvKUP2 基因的RT ‑qPCR结果， 选 择在不同地区转色肥最佳喷施 时期具有相 似表达模式的基因为判断转色肥喷施的marker 基因， 基因在此时的表达模式为 转色肥喷施时期的特 征表达信号。 9.根据权利要求8所述的一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组的筛选方 法， 其特征在于， VvKUP1基因的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1~2所示；VvKUP2基因的 引物对： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3~4所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891913 A 2一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组及其应用 技术领域 [0001]本发明属于植物生物技术领域， 具体涉及用于一种用于葡萄转色肥最佳施用时期 判断的引物组及其应用。 背景技术 [0002]根据 《中国农业统计年鉴》 统计数据， 截止到2019年， 我国葡萄栽培面积已经达到 了726.20公顷， 仅次于柑橘、 苹果、 梨， 居于第四位。 葡萄是施肥需求量较大的果树， 不合理 使用化肥不仅会造成化肥浪费， 还会造成环境污染。 因此， 葡萄生产需要精确的施肥。 精准 施肥不仅可以节约肥 料， 平衡土壤养分， 还可以减少环境污染， 增 加葡萄产量。 [0003]葡萄作为钾质植物， 史祥宾对 ‘红地球’全年需钾量进行测定得出每生产1000kg果 实需从土壤中吸收4.0～7.2 kg的氧化钾。 葡萄果 实是重要的钾库， 在 整个生长过程中， 果实 的钾含量逐渐增加， 在着色期 至成熟期 达到最大值[2]。 磷钾是植物 生长必需的元素， 在植物 的生长发育过程中发挥着十分重要的作用， 特别是对葡萄果实的发育显得尤为重要。 在葡 萄果实中， 同时存在KUP/KT/HAK和Shaker两大基因家族， 共同调控钾在果实的运输与再转 运。 [0004]基因表达可以反应出植物的真实的生长和代谢状态。 另外基因表达早于作物的特 定形态变化， 可以进一步预测营养需求。 近几年， 葡萄全基因测序的完成促进了在葡萄生产 中的应用， 如王剑等利用葡萄氮代谢基因的表达评价不同氮肥肥效。 葡萄生长发育会受到 许多因素 的影响， 而基因表达可以准确反应葡萄所处的状态， 可以用于葡萄精准施肥 的判 定依据， 减少肥 料使用和肥 料浪费， 更好 地保护环境和土壤。 [0005]检索暂未发现利用基因的表达来判断葡萄转色肥的喷施时间。 发明内容 [0006]针对现有技术的不足， 本发明的第一个目的是提供一种判断葡萄转色肥最佳喷施 时期的引物组， 建立分子方法预测葡萄转色肥喷施时期； [0007]本发明第二个问题是提供 上述引物组在判断葡萄转色肥最佳喷施时期的应用。 [0008]为解决上述 技术问题， 本发明采用如下技 术方案： [0009]一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组， 包括如下两对引物： [0010](1)检测基因VvKUP1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1～2所示； [0011](2)检测基因VvKUP2的引物对： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3～4所示； [0012]本发明还保护一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的检测试剂盒， 包括前文所 述的引物组。 [0013]本发明还保护前述引物组、 前述试剂盒在叶面喷施 葡萄转色肥施用时期的应用。 [0014]本发明还保护一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法， 包括如下步骤： [0015](1)取葡萄叶片， 提取RNA， 并反转录为cDNA， 以SEQ  ID NO： 1～2、 SEQ  ID NO： 3～4 为引物， 荧 光定量PCR扩增VvKUP1基因、 VvKUP2基因；说　明　书 1/4 页 3 CN 114891913 A 3