(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210483326.9 (22)申请日 2022.05.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574634 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 山东康华生物医疗科技股份有限 公司 地址 261023 山 东省潍坊市经济开发区月 河路699号 专利权人 青岛汉唐生物科技有限公司 (72)发明人 杨帆　郑国华　田永帅　陈欢　 刘嘉男　左雪梅　刘万建　宋金铃　 (74)专利代理 机构 潍坊盛润知识产权代理事务 所(普通合伙) 37299 专利代理师 李光林(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 王瑶 (54)发明名称 用于检测犬副流 感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬 支原体的引物探 针组合物、 试剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明提供用于检测犬副流感病毒、 犬腺病 毒Ⅱ型和犬支原 体的引物探针组合物、 试剂盒及 其制备方法， 所述引物探针组合物包括： 针对犬 副流感病毒设计的上下游引物和荧光探针， 序列 如SEQ ID NO.1‑3所示； 针对犬腺病毒 Ⅱ型设计 的上下游引物和荧光探针， 序列如SEQ  ID NO.4‑ 6所示； 针对犬支原体设计的上下游引物和荧光 探针， 序列如SEQ  ID NO.7‑9所示； 针对拟南芥 SUC2基因设计外参的上下游引物和荧光探针， 序 列如SEQ ID NO.10‑12所示。 本发明可以同时检 测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支原体， 且 灵敏度高、 特异性 好。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图9页 CN 114574634 B 2022.07.15 CN 114574634 B 1.用于检测犬副 流感病毒、 犬腺病 毒Ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物， 其特征在于： 所述引物探针组合物包括针对犬副流感病毒设计的上游引物、 针对犬副流感病毒设计的下 游引物、 针对犬副流感病毒设计的荧光探针、 针对犬腺病毒 Ⅱ型设计的上游引物、 针对犬腺 病毒Ⅱ型设计的下游引物、 针对犬腺病毒 Ⅱ型设计的荧光探针、 针对犬支原体设计的上游 引物、 针对犬支原体设计的下游引物、 针对犬支原体 设计的荧光探针、 针对拟南芥SUC2基因 设计外参的上游引物、 针对拟南芥SUC2基因设计外参的下游引物以及针对拟南芥SUC2基因 设计外参的荧 光探针； 所述针对犬副流感病毒设计的上游引物： 序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述针对犬副流感病毒设计的下游引物： 序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述针对犬副流感病毒设计的荧光探针： 序列如SEQ  ID NO.3所示； 该荧光探针的5 ’端 标记为报告基团6 ‑FAM， 3’  端标记为猝灭基团BHQ1； 所述针对犬腺病毒 Ⅱ型设计的上游引物： 序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述针对犬腺病毒 Ⅱ型设计的下游引物： 序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述针对犬腺病毒 Ⅱ型设计的荧光探针： 序列如SEQ  ID NO.6所示； 该荧光探针的5 ’端 标记为报告基团ROX， 3 ’端标记为猝灭基团BHQ2； 所述针对犬支 原体设计的上游引物： 序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述针对犬支 原体设计的下游引物： 序列如SEQ  ID NO.8所示； 所述针对犬支原体设计的荧光探针： 序列如SEQ  ID NO.9所示； 该荧光探针的5 ’端标记 为报告基团C Y5， 3’端标记为猝灭基团BHQ1； 所述针对拟南芥SUC2基因设计外参的上游引物： 序列如SEQ  ID NO.10所示； 所述针对 拟南芥SUC2基因设计外参的下游引物： 序列如SEQ  ID NO.11所示； 所述针对拟南芥SUC2基 因设计外参的荧光探针： 序列如SEQ  ID NO.12所示； 该荧光探针的5 ’端标记为报告基团 VIC， 3’端标记为猝灭基团BHQ1。 2.用于检测犬副 流感病毒、 犬腺病 毒Ⅱ型和犬支原体的试剂 盒， 其特征在于： 包括的反 应缓冲液、 阴性对照、 阳性对照和外参； 所述反应缓冲液包括具有如SEQ  ID NO .1‑SEQ ID  NO .12所示核苷酸序列的引物探针组合物、 反应酶和反应Buf fer。 3.根据权利要求2所述的用于检测犬副 流感病毒、 犬腺病 毒Ⅱ型和犬支原体的试剂 盒， 其特征在于： 所述阴性对照为TE  Buffer； 所述阳性对照为犬副流感病毒人工合成质粒、 犬 腺病毒Ⅱ型人工合成质粒、 犬支原体人工合成质粒 的质粒混合液， 所述犬副流感病毒人工 合成质粒、 犬腺病毒 Ⅱ型人工合成质粒、 犬支 原体人工合成质粒的浓度比为1： 1： 1。 4.根据权利要求2所述的用于检测犬副 流感病毒、 犬腺病 毒Ⅱ型和犬支原体的试剂 盒， 其特征在于： 所述外参 为插入了拟南芥SUC2基因序列片段的质粒， 浓度为5 ×106拷贝/mL。 5.用于检测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支原体的试剂盒的制备方法， 其特征在 于： 包括以下步骤： 配置 反应缓冲液、 配制阴性和阳性对照、 配制外参、 组装成检测试剂盒以 及构建反应程序； 所述配置反应缓冲 液： 将如SEQ  ID NO .1‑SEQ ID NO .12所示核苷酸序 列的引物和探针分别配置为10 μM 。 6.根据权利要求5所述的用于检测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支原体的试剂盒 的制备方法， 其特征在于： 所述构建反应程序：  反应程序包括50℃逆转录10min； 95℃预变 性5min； 扩增反应： 95℃反应15s， 6 0℃反应3 0s， 循环40次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574634 B 2用于检测犬副流感病毒 、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支原体的引物探 针组合物、 试剂盒及其制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及用于检测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型 和犬支原体的引物探针组合物、 试剂盒及其制备 方法。 背景技术 [0002]随着国民生活水平的提高， 宠物犬饲养量大幅上升， 为保障宠物犬及犬主人的健 康， 宠物犬病原体检测需求日益增长。 引起犬类发生呼吸道疾病的病原体有多种， 且存在同 时感染的情况。 常见的犬呼吸道病原体有 犬副流感病毒， 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支 原体。 [0003]犬副流感病毒 （Canine  Parainflu enza Virus,CPIV） 感染是犬的主要的呼吸道传 染病。 CPIV在分类上属副粘病毒科， 副粘病毒属， 核酸型为单股RNA。 临床表现发热、 流涕和 咳嗽。 近年来研究认为， CPIV 也可引起 急性脑髓 炎和脑内积水， 临床表现后躯麻痹和运动失 调等症状。 [0004]犬腺病毒 Ⅱ型 （Canine  Adenovirus  Type‑Ⅱ, CAV‑Ⅱ） 属于腺病毒属， 可引起犬 的传染性喉气管炎及肺炎症状， 临床特征表现持续性高热、 咳嗽、 浆液性至粘液性鼻漏、 扁 桃体炎、 喉气管炎和肺炎， 严重情况 下可致死亡。 [0005]犬支原体 （Mycoplasma  canis， MC） 是犬的呼吸道和泌尿生殖道共生菌， 主要引起 犬呼吸道疾病、 泌尿生殖道疾病、 贫血症、 关节炎及结肠炎等。 支原体常与其他细菌或病毒 混合或继发感染， 并加重疾病症状， 如不及时治疗会引起病原扩散以及其他组织器官 的损 伤。 [0006]这三类病原体检测方法主要包括分离培养、 血清学检测或普通PCR等。 分离培养是 最可靠的检测方法， 但是由于此方法耗时长、 敏感性差， 且操作较为复杂， 不能满足宠物犬 病原检测的需求； 血清学检测方法易与各种病原体之间存在交叉反应， 对病原体鉴定不够 友好； 常规PCR方法灵敏度不高， 容易受到环境的污染产生假阳的现象， 且不能做到多通道 检测。 为解决以上问题， 亟需建立一种快速、 准确且检测通量高的方法， 以应对持续增长的 宠物检测需求。 鉴于此， 本发明基于灵敏度高、 特异 性好的荧光定量P CR检测技术， 可以由一 次反应检测犬副流感病毒， 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支 原体三种 病原体。 发明内容 [0007]针对上述技术缺陷， 本发明提供用于检测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支原 体的引物探针组合物、 试剂盒及其制备方法， 达到以下发明目的： 可以同时检测犬副流 感病 毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支 原体， 并且灵敏度和特异性 好。 [0008]本发明采用的技 术方案为： [0009]用于检测犬副流感病毒、 犬腺病毒 Ⅱ型和犬支 原体的引物探针组合物包括： [0010]SEQ ID NO.1： 针对犬副流感病毒设计的上游引物， 该上游引物的序列为5 ’ ‑ cgatggctttgaggagggatc‑3’  ； 简称CPIV ‑F1；说　明　书 1/8 页 3 CN 114574634 B 3