(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210482181.0 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 张永宁　曾建宇　王文龙　周磊　 盖新娜　韩军　郭鑫　杨汉春　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) G01N 33/543(2006.01) (54)发明名称 检测PDCoV的RT-RAA -LFD引物对、 探针、 试纸 条、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及动物疫病检测技术领域， 具体涉 及检测PDCoV的RT ‑RAA‑LFD引物对、 探针、 试纸 条、 试剂盒及其应用。 本发明以PDCoV的ORF1b基 因为诊断靶 标， 设计、 筛选、 优化并最终获得了能 够特异性检测PDCoV核酸的引物对与探针。 使用 本发明的引物对、 探针、 试剂盒和试纸条可以实 现对PDCoV 的快速检测， 等温扩增所得产物用核 酸检测试纸条检测后直接进行结果判读。 整个检 测过程无需昂贵的仪器设备， 仅通过肉眼判读即 可获得检测结果。 本发明在基层和现场快速检测 与甄别PDCoV感染方面具有广阔的应用前 景。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图7页 CN 114703179 A 2022.07.05 CN 114703179 A 1.引物探针组合， 其特征在于， 所述引物的序列如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.16所示， 所述探针的序列如SEQ  ID NO.17所示。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述探针的5 ’端进行生物素修 饰， 第32位碱基C被四氢呋喃(THF)替代， 3 ’端进行磷酸化修饰； 反向引物的5 ’端进行荧光基 团FAM修饰； 所述探针序列如下： 5’ ‑Biotin‑GGTCCAGAGTACCGCTGTGAGGAGCCGCTTG[THF]TAAATTAGTAGGAGT ‑ Phosphorylati on‑3’ 所述反向引物序列如下： 5’ ‑FAM‑ACGTGTTAGGAACATATTATGATACGCATC ‑3’。 3.权利要求1‑2任一项所述引物探针组合， 在制备PDCoV的检测试剂盒或检测试纸条中 的应用。 4.一种PDCoV的RT ‑RAA‑LFD检测试剂盒， 其特征在于， 含有权利要求1 ‑2任一项所述的 引物探针组合。 5.根据权利要求4所述的RT ‑RAA‑LFD检测试剂盒， 其特征在于， 所述RT ‑RAA‑LFD检测试 剂盒还包括， 反应缓冲液和酶类。 6.根据权利要求5所述的RT ‑RAA‑LFD检测试剂盒， 其特征在于， 所述酶类包括逆转录 酶、 重组酶、 DNA聚合酶、 单链DNA结合蛋白和核酸内切酶IV。 7.一种PDCoV核酸的检测试纸条， 其特征在于， 用于检测权利要求4 ‑6任一项所述RT ‑ RAA‑LFD检测试剂盒， 扩增得到的产物， 所述检测试纸条包括： 样品结合垫、 检测线、 质控线； 所述样品结合垫含有胶体金标记的链霉亲和素、 检测线(T线)含有鼠抗FAM的单克隆抗体、 质控线(C线)含有偶联 牛血清白蛋白(BSA)的生物素。 8.权利要求7所述检测试纸条的使用方法， 其特征在于， 包括： 以待测样品中提取的RNA 为模板， 使用权利要求4 ‑6任一项所述RT ‑RAA‑LFD检测试剂盒， 进行扩增， 获得扩增产物， 采 用所述检测试纸条对所述扩增产物进行 可视化判读； 结果判定标准为： 阳性结果出现两条红色条带， 一条位于检测线(T线)， 另一条位于质 控线(C线)； 阴性结果仅在质控线(C线)出现一条红色条带， 而在检测线(T线)无 红色条带出 现； 若仅检测线出现红色条 带， 而质控线不出现红色条 带， 则为无效检测结果。 9.根据权利要求8所述的使用方法， 其特征在于， 所述扩增的反应条件为40℃恒温扩增 10min。 10.权利要求1‑2任一项所述的引物探针组合或权利 要求4‑6任一项所述的RT ‑RAA‑LFD 检测试剂盒 或权利要求7 所述的检测试纸条在可视化判定P DCoV感染中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703179 A 2检测PDCoV的RT‑RAA‑LFD引物对、 探针、 试纸条、 试剂盒及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及动物疫病检测 技术领域， 具体涉及一种检测PDCoV核酸的RT ‑RAA‑LFD 引物对、 探针、 试纸条、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]PDCoV是近年来新发现的一种猪肠道致病性冠状病毒， 主要感染新生仔猪， 临床症 状表现为急性腹泻、 呕吐、 脱水和消瘦等， 严重者发生死亡， 已成为影响养猪生产的重要病 原之一； 尽管其他年龄阶段的猪也可以感染， 但症状相 对轻微。 PDCoV既可以通过健康猪直 接接触带毒猪或患病猪的多种分泌物(如粪便、 呕吐物、 唾液、 乳汁、 鼻腔分泌物和精液等) 而发生感染， 也可以通过间接接触受病毒污染的饲料、 器具、 运输工具和饲养员等而发生感 染。 2012年， W oo等从2007～2011年间采集的猪粪便拭子中首次测得P DCoV的全基因 组序列。 [0003]已有研究表明， 除了感染猪之外， PDCoV也能够感染野鸟、 鸡、 火鸡、 牛等不同种属 动物， 说明该病 毒具有潜在的跨物种传播风险(Zhang  J.,Virus  Research,2016,226:71 ‑ 84)。 2021年， 有研究从3名具有发热和腹痛症状的海地儿童血液中分离出PDCoV， 表明PDCoV 具有潜在的公共卫 生意义(Lednicky J.A.,Nature,2021,6 00:133‑137)。 [0004]在分类上， PD CoV属于套式病毒目(Nidovirales)、 冠状病毒 科(Coronavir idae)、 δ 冠状病毒属(Deltacoronavirus)。 PDCoV是有囊膜的单股正链RNA病毒， 其基因组结构为： 5 ’ UTR‑ORF1a/1b ‑S‑E‑M‑NS6‑N‑NS7‑3’UTR， 全长约25kb。 其中ORF1a和ORF1b编码两个多聚蛋 白pp1a和pp1ab， 据推测， pp1a和pp1ab可被ORF1a/1b编码的蛋白酶切割成约16个非结构蛋 白， 主要参与病毒复制与转录。 鉴于PDCoV感染所导致的临床症状与猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)等重要致猪腹泻性病毒十分相 似， 因此确诊PDCoV感染 需要依靠实验室检测技术。 目前， 国内外主要依靠RT ‑PCR、 实时荧光 定量RT‑PCR和环介导等 温扩增(LAMP)等分子生物学方法以及间接免疫荧光、 病毒中和试验 以及间接ELISA等血清学方法对PDCoV感染进行检测与诊断。 其中， RT ‑PCR、 实时荧光定量 RT‑PCR和LAMP等分子生物学检测方法涉及到的诊断靶标包括S、 M、 N和ORF1等基因。 尽管上 述检测方法在PDCoV的检测与诊断中发挥了重要作用， 但均普遍存在操作复杂、 耗时长、 对 仪器设备要求较高或引物设计过于复杂等不足， 难以满足临床上对PDCoV感染猪进行现场 快速和可视化检测的实际需求。 [0005]近年来 ， 一种基于重组酶介导等温核酸扩增(Recombinase ‑aided  amplification， RAA)技术在人医和兽医疾病诊断与检测中正在显示出良好的应用潜力， 已 经引起了全世界的广泛关注。 譬如， 基于RAA与侧向流免疫层析技术的病原体核酸检测方法 已经成功应用于新型冠状病毒(SARS ‑CoV‑2)和非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速诊断， 并已经申 请了国家发明专利保护。 RAA技术主要依靠单链DNA结合蛋白(通过与单链DNA结合， 维持DNA 的单链状态， 防止其重新配对形成双链DNA)、 重组酶(能与引物形成复合物， 促进引物与模 板DNA的同源序列配对， 启动DNA复制)和DNA聚合酶(用于扩增和延伸)在恒温条件下(37～说　明　书 1/9 页 3 CN 114703179 A 3