(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210480269.9 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 江苏省食品药品监 督检验研究院 地址 210019 江苏省南京市 建邺区康文路 17号 (72)发明人 赵述强　高巾媛　陆益红　庞庆林　 严方　史清水　 (74)专利代理 机构 北京德崇智捷知识产权代理 有限公司 1 1467 专利代理师 王斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA 的试剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明涉及RAA法， 具体涉及一种实时荧光 RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒及其检测 方法。 该试剂盒包括引物和探针， 该方法特异性 良好， 检测灵敏度为0.0696ng/剂量， 满足 《中国 药典》 2020年版三部中规定的狂犬疫苗原液中残 留DNA应不高于 3ng/剂量的检测要求。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 114934100 A 2022.08.23 CN 114934100 A 1.一种实时荧 光RAA法检测 Vero细胞残留DNA的试剂盒， 其特 征在于包括 引物： F2‑5’ ‑CTGGACAGAAGCTCTCTGAGACACTGCTCTGTG ‑3’ R2‑5’ ‑CGATGCTTCTCTCCAGTTCTGAACGGAAGATAT‑3’ 探针P1： 5 ’ ‑GAGTTACATCTCTACCTTCAAGAAGCCTT （FAM ‑dt） CG(THF)(BHQ1 ‑dt) AAGGCTGTTCTTGTG‑(3’ ‑phosphate)。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于其还含有包括装有反应干粉的检测单元 管， 反应缓冲液， 醋酸镁， 阳性对照； 反应干粉 是采用为低温冷冻干燥技术 获得的冻干粉末， 主要成分为重组酶、 单链结合蛋白、 DNA聚合酶、 dNTPs和ATP； 反应缓冲液包括以下含量组 分： 浓度为3 00mM的Tris ‑HCl 缓冲液pH =8.0、 120mM醋酸钾 和质量分数为20%的PEG 20 000。 3.根据权利要求2所述的一种实时荧光RAA法检测 Vero细胞残留DNA的试剂盒的检测 方法， 其特征在于将装有权利要求2所述的冻干粉反应管中加入： 上游引物10的冻干粉反应 管中， 下游引物10游引物粉反应管中， 探针10针引物粉反应管中， 反应缓冲液25应缓， 双蒸 水15.7冲液， 模板2模板以及醋酸镁280mmol/L 2.5游引； 反应条件为： 39℃， 60个循环， 每个 循环30秒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934100 A 2一种实时荧光RA A法检测Vero细胞 残留DNA的试剂盒及其检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及RAA法， 具体涉及一种实时荧光RAA法检测Vero细胞残留DNA的试剂盒 及其检测方法。 背景技术 [0002]Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。 该细胞系由日本千 叶大学的Yasumura和Kawakita于1962年3月27日扩增出来； Vero细胞被广泛应用于病毒感 染分子机制研究、 疫苗及重组蛋白的生产， 世界卫生组织甚至认可其作为疫苗生产细胞系， 建议将其作为流感疫苗生产的替代基质。 近年来， 我国多采用Ver o细胞培养狂犬疫苗， 与 原 代细胞相比， Vero细胞的传代细胞效果更好， 质量更高， 成本更低， 但因传代细胞调控生长 的基因失调， 使其具有 无限的寿命， 从而存在着潜在的安全风险。 因此需要对Ver o细胞培养 的狂犬疫苗中残留DNA进行监测， 确保其在安全范围内， 从而保证疫苗的安全性与可靠性。 [0003]我国监管部门关于残留DNA的限度要求主要参考WHO、 FDA及欧洲的指南， 在 《中国 药典》 2020版 《人用重组单克隆抗体制品总论》 工艺相关杂质部 分提出应采用适宜的方法对 供试品中宿主细胞和载体DNA进 行检测， 要求测定结果应在规定的范围内， 如对于Vero细胞 培养的疫苗中残留DNA应不高于50pg/剂量。 此外， 《中国药典》 2020年版三部在 《人用基因治 疗制品总论》 中明确提取和纯化工艺应保证将制品的一些特定工艺杂质去除或降至可接受 的水平， 其中特定 工艺杂质包括表达载体的核酸和宿主细胞的DNA。 [0004]2006年， Piepenburg等人首次报道重组酶等温扩增技术， 该技术不依赖于热循环 仪， 无需温控设备， 在常温下即可完成扩增， 且扩增速度较快， 10 ‑20分钟即可判定扩增结 果， 可真正 实现便携式核酸快速检测。 目前， 重组酶等温扩增技术包括重组酶聚合酶扩增技 术(Recombinase  polymerase  amplification,RPA)和重组酶介导的核酸扩增技术 (Recombinase mediated  acid amplification,RAA)两种， 其区别在于RPA是噬菌体重组酶 而RAA是细菌或真菌中获得的重组酶， 因RAA中的重组酶来源广泛， 且具有我国自主知识产 权， 现应用较多。 该技术主要依赖重组酶、 单链DNA结合蛋白(single ‑stranded  binding  protein， SSB)和DNA聚合酶。 然后在一些辅助成分， 如重组酶加载因子， dNTP， 三磷酸腺苷 (ATP)， 高分子量聚乙二醇， 盐分子等的配合下完成整个反应。 反应开始时， 重组酶在加载因 子的辅助下与引物结合形成重组酶引物复合体， 形成的复合体在双链DNA中寻找同源序列， 定位后入侵双链DNA， 形成D ‑环结构， 双链DNA解开， 单链结合蛋白(SSB)结合被置换的DNA 链， 防止引物解离。 随后， 重组酶引物复合体中的重组酶被水解， 引物的3' ‑端暴露并与DNA 聚合酶(Bsu或Sau)结合， 开始DNA链的合成。 最终， 两条母链分离， 得到两条新的互补双链， 水解后的重组酶可立即与新的引物结合从而启动另一条链置换反应。 以上过程的重复进 行 使DNA扩增呈指数 型积累。 [0005]重组酶等温介导核酸扩增技术作为一种新型核酸体外扩增技术， 其具有冻干颗粒 易于储存和运输、 反应时间快、 无需严格温度控制、 灵敏度高、 特异性强、 操作简单等优点，说　明　书 1/8 页 3 CN 114934100 A 3