(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210483183.1 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 普诺圣肽 （苏州） 生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市吴江区东太湖 生态旅游度假区 （太湖新城） 简村路 100号苏州湾智慧信息产业园17层 1701室10号工位 （集群登记） (72)发明人 马美荣　马丽荣　马桂连　赵真真　 (74)专利代理 机构 南京常青藤知识产权代理有 限公司 32 286 专利代理师 蔡赪劼 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6818(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方 法及其应用 (57)摘要 本发明涉及检测技术领域， 特别是涉及一种 基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法及其应 用， 该检测方法采用由阪崎肠杆菌rpoB基因设计 得到的RPA扩增引物组， 在等温条件下利用 Cas12a蛋白、 crRNA、 DNA报 告分子和RPA扩增引物 组检测阪崎肠杆菌。 本发明提供了一种方便快 捷、 准确度高的阪崎肠杆菌检测方法， 可准确鉴 定阪崎肠杆菌DNA， 操作简便， 无需像PCR一样通 过变温仪器实现扩增检测， 只需在37℃下进行等 温扩增， 10～6 0min即可完成检测。 权利要求书2页 说明书5页 序列表7页 附图1页 CN 114807396 A 2022.07.29 CN 114807396 A 1.一种基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 采用由阪崎肠杆菌rpoB 基因设计得到的RPA扩增引物组， 在等温条件下利用Cas12a蛋 白、 crRNA、 DNA报告分子和所 述RPA扩增引物组检测阪崎肠杆菌， 具体包括如下步骤： S1、 制备Cas12蛋白； S2、 根据保守的阪崎肠 杆菌rpoB基因设计RPA扩增引物组， 所述RPA扩增引物组经NCBI ‑ blast比对显示， 为特异的阪崎肠杆菌序列， 所述阪崎肠杆菌rpoB基因的(核苷酸)序列如 SEQ ID NO.4所示， 所述RPA扩增引物组由上游引物和下游引物组成， 其中： 上游引物的序列如SEQ  ID NO.1所示； 下游引物的序列如SEQ  ID NO.2所示； S3、 基于Cas12a蛋白的特点， 将扩增的基因片段序列设计为能够特异识别阪崎肠杆菌 的crRNA， 所述crRNA经NCBI ‑blast比对显示， 为特异的rpoB基因序列， 所述crRNA的序列如 SEQ ID NO.3所示； S4、 基于Cas12a蛋白的特点， 构建DNA报告分子； S5、 将如步骤S2所述的阪崎肠杆菌rpoB基因中的VP72基因的核酸序列克隆至pUc57质 粒中， 培养、 提取得到阳性质粒(含有阪崎肠杆菌DNA片段的质粒)； S6、 将步骤S5得到的阳性质粒制备成标准工作品， 并将所述标准工作品加入扩增检测 体系中， 混合均匀后恒温反应15分钟， 得到反应产物； S7、 将步骤S6得到的反应产物配制成CRISPR ‑Cas12a检测体系， 再将所述CRISPR ‑ Cas12a检测体系放入常温等温扩增荧 光检测仪中恒温反应时间6 0分钟， 得到检测结果。 2.根据权利 要求1所述的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 步骤S4中， 所述DNA报告分 子序列为： 荧光基团 ‑TTATT‑淬灭基团， 所述荧光报告基团为FA M、 HEX、 TET、 JOE或VIC中的任 意一种， 所述 荧光淬灭基团为BHQ1、 BHQ2或BHQ3中的任意 一种。 3.根据权利要求1所述的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 步骤S6中， 扩增检测体系 包括如下组分： 4.根据权利要求3所述的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 所述核酸模板为步骤S6所 述的标准工作品。 5.根据权利要求1所述的阪崎肠 杆菌检测方法， 其特征在于， 步骤S7中， CRISPR ‑Cas12a 检测体系包括以下组分：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807396 A 26.根据权利 要求1‑4中任意一项所述的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 所述Cas12a 蛋白为LbCas12a。 7.根据权利要求1 ‑4中任意一项所述的阪崎肠杆菌检测方法， 其特征在于， 检测时的等 温条件为37℃。 8.一种如权利要求1所述的基于Cas12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法在食品检测中的应 用。 9.根据权利要求8所述的一种基于C as12a蛋白的阪崎肠杆菌检测方法在试剂盒中的应 用， 其特征在于， 检测方式包括但不限于试剂盒。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807396 A 3