(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210478184.7 (22)申请日 2022.05.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574600 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 苏州鱼之源生物科技有限公司 地址 215141 江苏省苏州市相城区阳澄湖 消泾村 (72)发明人 杜佳　刘青华　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 106947827 A,2017.07.14 CN 113774122 A,2021.12.10 CN 114107522 A,2022.03.01 TONY GAMBLE et al.,. “Identificati on of sex-specific mo lecular markers usi ng restricti on site-as sociated DNA sequenci ng”. 《Molecular E cology Resources》 .2014,第14卷(第5期),第902-913 页. 审查员 汪豪杰 (54)发明名称 一种美洲鲥鱼雄性分子标记及其特异性引 物对和应用 (57)摘要 本发明公开了一种美洲鲥鱼雄性分子标记 及其特异性引物对和应用。 本发 明首次获得了一 段能够鉴别美洲鲥鱼雄性标记分子， 而且基于该 标记分子进一步获得了能够扩增该标记分子的 特异性引物及其相应的试剂盒， 该特异性引物及 其试剂盒能够准确地区分遗传性雄鱼 （xy雄鱼） 和生理性雄 鱼 （即xx假雄鱼） ； 本发明采用从尾鳍 条提取DNA方法提供了一种无创鉴别美洲鲥 鱼雌 雄的DNA标记方法， 对美洲鲥鱼进行遗传性别鉴 定， 而且可以在鱼苗或幼鱼阶段进行性别鉴定， 使用高通量扩增检测方法， 可完成大批量样本的 性别鉴定； 本发明操作简便， 节省成本， 本发明的 引物对鲥鱼性别鉴定的准确度为10 0%。 权利要求书1页 说明书11页 序列表5页 附图2页 CN 114574600 B 2022.08.12 CN 114574600 B 1.用于检测基因片段的特异性引物对， 其特征在于， 所述引物对序列如SEQ  ID NO： 3和 SEQ ID NO： 4所示， 所述基因片段的碱基序列如SEQ  ID NO： 2所示。 2.权利要求1所述的特异性引物对在制备鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂盒中的应 用。 3.一种鉴定美洲鲥鱼的遗传性别的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所 述的引物对。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括DNA提取试剂， PCR扩 增试剂， DNA分子标记和核酸染料。 5.一种鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： （1） 提取 未知性别的美洲鲥鱼的DNA， （2） 采用权利要求1所述的特异性引物对或权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增， （3） 当PCR扩增产物显示470bp条带时， 即可判断为雄性美洲鲥鱼，  当PCR扩增产物未发 现有470bp条 带时， 即可判断为雌性美洲鲥鱼。 6.根据权利 要求5所述的鉴别美洲鲥鱼性别的DNA标记方法， 其特征在于， 所述PCR扩增 体系包括： 2   × Taq 反应混合物II、 权利要求3所述的特异性引物对、 DNA、 H2O； PCR反应条 件如下： 95℃预变性3mi n， 95℃变性15s， 6 0℃退火3 0s， 72℃延伸1mi n， 72℃终延伸5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574600 B 2一种美洲鲥鱼雄性分子标记及其特异性引物对和应用 技术领域 [0001]本发明属于鱼类遗传学领域， 具体涉及一种美洲鲥鱼雄性分子标记及 其特异性引 物对和应用。 背景技术 [0002]美洲鲥鱼( Alosa sapidissima )原产于北美洲大西洋海岸， 与中国鲥鱼同属不同 种， 具有相同的溯河产卵习性， 其形态特征、 鱼肉品质和品味等都与中国鲥鱼十分相似。 在 中国鲥鱼濒临灭绝的情况下， 美洲鲥鱼作为替代种于2003年被引入我国开始养殖。 鲥鱼是 一种娇嫩的惜鳞 鱼， 一旦受到惊吓会四处乱窜， 相互撞击， 导致鳞片脱落， 引发皮肤溃疡， 患 水霉病死亡， 所以， 避免鲥鱼受伤是鲥鱼养殖成败的关键措施之一。 经过多年的养殖技术研 发， 鲥鱼养殖模式从小水体网箱或水泥池养殖逐步发展到温室大水体养殖， 从而降低了鲥 鱼受惊后， 相互撞击受伤的机率， 鲥鱼养殖获得初步成功， 美洲鲥鱼已成为国内淡水养殖最 名贵品种之一， 发展前 景良好。 [0003]然而， 美洲鲥鱼的雌雄鱼生长差异较大， 雄鱼生长比雌鱼生长慢32.4% （如图1所 示） ， 而且， 雄鱼是鲥鱼养殖的 “麻烦制造者 ”。 这是因为未成熟的一令雄鱼和成熟的二令雄 鱼在春季有着强烈的追逐雌鱼的性行为， 追尾持续4个月之久， 而且每天持续3 ‑4个小时。 雄 鱼强烈的性追尾行为不仅导致撞伤、 鳞片脱落 或死亡， 而且造成雌雄鲥鱼大量的体能消耗， 成为春季死亡率高、 体重下降的主要原因， 增加了养殖风险， 降低了产量， 严重制约着鲥鱼 养殖产业的发展。 通过性别控制， 进行全雌鲥鱼养殖， 可以发挥雌鱼生长快的优势， 生产市 场价格高昂的大规格鲥鱼商品鱼， 而且可以有效避免雄鱼追尾造成的损失， 将成为提高鲥 鱼养殖成活率和生长率， 增 加经济效益， 促进鲥鱼养殖业发展的重要措施。 [0004]全雌鲥鱼生产是通过制作xx假雄鱼 （xx  neomales） 实现的。 所谓的xx假雄鱼是性 激素诱导的雌鱼， 它拥有成熟的精巢， 但是， 其遗传型为xx雌鱼； 由xx假雄鱼与正常 的雌鱼 （xx） 交配生产的后代全部为xx雌鱼。 xx假雄鱼主要是通过在幼鱼阶段实施 雄性激素饲料 投 喂， 完成性别转化的， 但是生产出雄鱼包括xy雄鱼和xx假雄鱼， 二者在形态无异， 必须借助 雄性DNA标记才能将xx假雄鱼从包括xy雄鱼中分辨出来， 最后， 由xx假雄鱼与正常的雌鱼 （xx） 交配， 生产全雌鱼。 可见， 雄性特异性DNA标记的筛选和应用是实施全雌鲥鱼生产的关 键。 [0005]鱼类性别决定基因的研究是多年来科学家的备受关注的鱼类热点研究之一。 目 前， 性别特异性的遗传标记主要 是集中在鲑 鱼、 罗非鱼和一些鲤科鱼类。 鲥鱼以及类似的鲱 科鱼的性决定基因标记尚未有报道。 筛选DNA性别标记并发展出鉴别雌雄鱼遗传性别的方 法， 不仅对单性养殖有重要的意义， 而且对鱼类性别决定遗传机制 研究和生物信息具有重 大的理论 意义与应用价 值。 [0006]简化基因组 （RAD） 是对酶切获得的RAD  标签 （tag） 进行高通量测序技术。 它可以通 过限制性核酸内切酶识别位点相关DNA， 产生特异的切口片断， 然后以这些片段作为模板， 进行高通量测序文库的构建， 然后借助高通量测序， 获得大量的酶切片断的序列。 这种方法说　明　书 1/11 页 3 CN 114574600 B 3