(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221048176 0.3 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 石家庄秀卿生物科技有限公司 地址 050090 河北省石家庄市新石北路3 68 号金石工业园软件大厦C座108室 申请人 石家庄博维生物科技有限公司 　 河北科技大学 (72)发明人 艾鹏飞　王珊　高鸿涛　高辉明　 韩江雪　王雁伟　陈珊珊　庞艳荣　 张向阳　邢云颖　张贵海　 (74)专利代理 机构 北京名华博信知识产权代理 有限公司 1 1453 专利代理师 韩闪闪 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 乳品致病菌的检测试剂和乳品致病菌的检 测方法 (57)摘要 本申请公开了一种乳品致病菌的检测试剂 和乳品致病菌的检测方法。 所述乳品致病菌的检 测试剂包括用于检测大肠杆菌O15 7∶H7的引物对 和探针， 用于检测单增李斯特菌的引物对和探 针， 以及用于检测蜡样芽孢杆菌的引物对和探 针。 所述乳品致病菌的检测方法采用所述乳品致 病菌的检测试剂， 对乳品致病菌进行检测。 所述 乳品致病菌的检测方法可以一次性同时检测大 肠杆菌O157∶H 7、 单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌3 种致病菌， 并可以进行定量检测， 而且灵敏度高、 便捷、 高效。 权利要求书2页 说明书15页 序列表2页 附图8页 CN 114891905 A 2022.08.12 CN 114891905 A 1.一种乳品致病菌的检测试剂， 其特征在于， 包括： tir基因的引物对和探针、 mpl基因 的引物对和探针、 entFM基因的引物对和探针； 其中， 所述tir基因的引物对和探针用于检测大肠 杆菌O157∶H7， 所述mpl基因的引物对 和探针用于检测单增李斯特菌， 所述entFM基因的引物对和探针用于检测蜡样芽孢杆菌 。 2.根据权利要求1所述的检测试剂， 其特征在于， 所述tir基因的引物对如SEQ  ID NO： 1‑2所示， 所述tir基因的探针如SEQ  ID NO： 3所示； 所述 mpl基因的引物对如SEQ  ID NO： 4‑5 所示， 所述mpl基因 的探针如SEQ  ID NO： 6所示； 所述entFM基因 的引物对如SEQ  ID NO： 7‑8 所示， 所述entFM基因的探针如SEQ  ID NO： 9所示。 3.根据权利要求1所述的检测试剂， 其特征在于， 所述tir基因的探针上标记的荧光报 告基团为ROX， 所述tir基因的探针上标记的荧光淬灭基团为BHQ Ⅱ； 所述mpl基因的探针上 标记的荧光报告基团为FAM， 所述mpl基因的探针上标记的荧光淬灭基团为BHQ Ⅰ； 所述entFM 基因的探针上标记的荧光报告基团为HEX， 所述entFM基因的探针上标记的荧光淬灭基团为 BHQⅠ。 4.一种乳品致病菌的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法利用tir基因 的引物对和探 针、 mpl基因的引物对和探针、 以及entFM基因的引物对和探针， 在一次实时荧光定量PCR反 应中同时检测待测样品中的大肠杆菌O157∶ H7、 单增李斯特菌、 蜡样芽孢杆菌； 其中， 所述tir基因的引物对和探针用于检测所述大肠 杆菌O157∶H7， 所述mpl基因的引 物对和探针用于检测所述单增李斯特菌， 所述entFM基因的引物对和 探针用于检测所述蜡 样芽孢杆菌 。 5.根据权利要求 4所述的检测方法， 其特 征在于， 包括： 设计所述tir基因的引物对和探针、 所述mpl基因的引物对和探针、 以及 所述entFM基因 的引物对和探针； 提取所述待测样品的DNA； 以提取的所述待测样品DNA为模板， 加入所述tir基因的引物对和探针、 所述mpl基因的 引物对和探针、 以及所述entFM基因的引物对和探针， 进行PCR反应， 同时收集 荧光信号； 根据所述荧光信号同时判断大肠杆菌O157∶H7、 单增李斯特菌、 蜡样芽孢杆菌的阴性或 阳性。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特 征在于， 包括： 绘制PCR对数扩增曲线图， 标记Ct值， 通过所述Ct值对所述待测样品中的大肠杆菌O157 ∶ H7、 单增李斯特菌、 蜡样芽孢杆菌进行定量分析。 7.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 在进行所述PCR反应时， PCR反应体系 为20 μL； 所述tir基因的引物对包括上游引物tir ‑F和下游引物tir ‑R， 所述mpl基因的引物对包 括上游引物mpl ‑F和下游引物mpl ‑R， 所述entFM基因的引物对包括上游引物entFM ‑F和下游 引物entFM ‑R； 所述PCR反应体系包括： 10μL的2 ×SuperReal ‑time PCR PreMix， 0.4μL的上游引物 tir‑F， 0.4 μL的下游引物tir ‑R， 0.4 μL的上游引物mpl ‑F， 0.4 μL的下游引物mpl ‑R， 0.4 μL的 上游引物entFM ‑F， 0.4 μL的下游引物entFM ‑R， 0.8 μL的tir基因 的探针， 0.8 μL的mpl基因 的 探针， 0.8 μL的entFM基因的探针， 1.0 μL的待测样品DNA模板， 余 量为超纯水。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891905 A 28.根据权利 要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述tir基因的引物对的浓度为8 ‑12 μ mol/L， 所述tir基因的探针的浓度为4 ‑6μmol/L， 所述mpl基因的引物对的浓度为13 ‑17μ mol/L， 所述mpl基因 的探针的浓度为4 ‑6 μmol/L， 所述entFM基因的引物对的浓度为13 ‑17 μ mol/L， 所述entFM基因的探针的浓度为 4‑6 μmol/L。 9.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述PCR反应的反应条件为： 95℃  13‑ 18分钟→(95℃ 3‑4秒， 60℃ 26‑34秒)×38‑42个循环。 10.一种乳品致病菌的检测试剂盒， 其特 征在于， 包括： 容器， 以及位于容器内的根据权利要求1所述的检测试剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891905 A 3