(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210478240.7 (22)申请日 2022.05.05 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574607 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 首都医科 大学附属北京友谊医院 地址 100050 北京市西城区永安路95号 (72)发明人 杨国威　吴云　 (74)专利代理 机构 北京领科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11690 专利代理师 徐丹丹　张丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/80(2006.01) C12R 1/645(2006.01) 审查员 白艳林 (54)发明名称 一种试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种试剂盒及其应用， 具体提 供了一种特异性引物和/或探针， 以及包含引物 和/或探针的试剂盒或芯片。 通过将包含利什曼 原虫、 马尔尼菲青霉菌和/或荚膜组织胞浆菌的 引物和/或探针组合在一起， 能够在一个检测反 应体系中同时检测三种病原 体， 缩短了单独检测 三种病原体的时间， 提高了 检测效率。 权利要求书1页 说明书14页 序列表6页 附图2页 CN 114574607 B 2022.08.23 CN 114574607 B 1.一种检测利什曼原虫、 马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的试剂盒或芯片， 其特征 在于， 所述的试剂盒或芯片中包含引物和探针， 所述的引物 为利什曼原虫、 马尔尼菲青霉菌 和荚膜组织胞浆菌的引物， 所述的探针为利什曼原虫、 马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌 的探针， 其中， 利什曼原虫的上游引物如SEQ  ID NO： 1所示， 下游引物如SEQ  ID NO： 2所示； 马尔尼菲青 霉菌的上游引物如SEQ  ID NO： 4所示， 下游引物如SEQ  ID NO： 5所示； 荚膜组织胞浆菌的上游引物如SEQ  ID NO： 7所示， 下游引物如SEQ  ID NO： 8所示； 利什曼原虫的探针如SEQ  ID NO： 3所示， 马尔尼菲青霉菌的探针如SEQ  ID NO： 6所示， 荚膜组织胞浆菌的探针如SEQ  ID NO： 9所示； 所述的探针的5 ’端包含荧光报告基团的修饰， 3 ’端包含荧光淬灭基团的修饰。 2.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片， 其特征在于， 所述的荧光报告基团选自VIC、 FAM、 Texas  Red、 TAMRA、 TET、 JOE、 HEX、 ROX、 LC  RED640、 LC  RED705、 CY3或CY5， 所述的荧光淬 灭基团选自TAMRA、 DABC YL、 BHQ1、 BHQ2或BHQ3 。 3.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片， 其特征在于， 所述试剂盒或芯片还包括PCR反 应的试剂， 所述的PCR反应的试剂选自Taq  DNA聚合酶、 dNTPs、 酶稳定剂、 Taq  DNA聚合酶反 应缓冲液、 溴酚蓝染料或水中的一种或两种以上的组合。 4.根据权利要求1 ‑3任一所述的试剂 盒或芯片， 其特征在于， 所述的试剂盒或芯片还包 含DNA提取 所需试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574607 B 2一种试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及病原体诊断技术领域， 具体涉及利什曼原虫、 马尔尼菲青霉菌和荚膜 组织胞浆菌的检测。 背景技术 [0002]利什曼病、 马尔尼菲青霉病和荚膜组织胞浆菌病常见于移植患者、 肿瘤患者以及 艾滋病患者等免疫功 能低下的人群。 这些病例临床表现均为不明原因的发热且持续时间、 发热程度不一； 肝脾肿大， 淋巴结肿大； 中至重度贫血， 白细胞减少等， 临床症状非常相 似， 骨髓涂片的镜下病原体形态、 大小较接近， 且都常位于吞噬细胞内， 容易混淆， 在临床上这 三种病原体感染的诊断具有一定的迷惑性， 容 易误诊。 [0003]三种病原体的现有检测方法如下： 对于利什曼原虫， 马尔尼菲青霉菌和荚膜组织 胞浆菌， 临床使用镜检、 培养以及免疫 学方法进 行诊断。 镜检和培养方法具有敏感度低和检 测周期长的缺 点； 免疫学 方法容易发生交叉反应， 特异性 不高， 容易误诊。 [0004]本发明应用利什曼原虫， 马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌的保守基因的序列设 计了引物探针组合构建了利什曼原虫， 马尔尼菲青霉菌和荚膜组织胞浆菌同步检测的三重 荧光定量PCR检测方法， 该方法具有敏感度高， 特异性好， 无需开盖有效避免了产物气溶胶 污染， 检测结果更准确的优势。 三种病原体同步检测与单独检测每一种病原体比较更高效， 大大缩短了检测时间， 同时三种 病原体同步检测具有鉴别诊断的优势。 发明内容 [0005]基于临床鉴别诊断的需求， 本申请应用内脏利什曼病感染原虫动基体DNA （mkDNA） ， 马尔尼菲青霉菌的ITS （internal  transcribed spacer， 转录间隔 区） 片段和荚膜 组织胞浆菌的 （internal  transcribed spacer， 转录间隔 区） ITS片段的保守区域设计了若 干特异性引物、 探针， 并将其形成不同的组合， 进 行检测， 特异 性的筛选出9条短序列在同一 体系中不出现交叉反应， 也没有形成二级结构的引物探针组合， 成功构建了三重荧光定量 PCR的鉴别诊断检测体系。 本申请使用的三种病原体的检测靶标具有拷贝数多， 种内较保 守， 可有效提高检测敏感度和特异 性。 该方法的建立使得 临床具有 可应用的准确、 便捷的利 什曼原虫， 马尔尼菲青 霉菌以及荚膜组织胞浆菌感染的鉴别诊断方法。 [0006]第一方面， 本 发明提供了一种引物， 所述的引物包含利什曼原虫、 马尔尼菲青霉菌 和/或荚膜组织胞浆菌的引物。 [0007]所述的利什曼原虫的引物扩增mkD NA。 优选的， 所述的利什曼原 虫的上游引物包含 SEQ ID NO： 1所示的核苷酸序列或者包含SEQ  ID NO： 1经过一个或几个核苷酸的取代、 缺失 和/或插入且与SEQ  ID NO： 1具有相同或相似功能的核苷 酸序列， 下游引物包含SEQ  ID NO： 2所示的核苷酸序列或者包含SEQ  ID NO： 2经过一个或几个核苷酸的取代、 缺失和/或插入 且与SEQ ID NO： 2具有相同或相似功能的核苷 酸序列。 进一步优选的， 所述的利什曼原虫的 上游引物如SEQ  ID NO： 1所示， 下游引物如SEQ  ID NO： 2所示。说　明　书 1/14 页 3 CN 114574607 B 3