(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210478447.4 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 山东信得科技股份有限公司 地址 262200 山东省潍坊市诸城市舜耕路 195号 申请人 山东信达基因科技有限公司 　 山东诸子生物科技有限公司 (72)发明人 王雪　刘春国　孙娜娜　石豪　 王猛　朱浩　程仕强　杨天耀　 刘丰欣　李朝阳　马广斌　宋桂才　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 于晶晶 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴别MG的TS-11疫苗株和野毒株的引物探针 组合、 方法及应用 (57)摘要 本发明提出鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株 的引物探针组合、 方法及应用。 其引物探针组合 包括共同上游引物、 共同下游引物、 TS ‑11疫苗株 探针和野毒株探针， 共同上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO:1所示， 共同下游引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO:2所示； TS ‑11疫苗株探针的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 野毒株探针的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:4所示； TS ‑11疫苗株探针和 所述野毒株探针的5 ’端均标以荧光报告基团， TS‑11株探针和所述野毒株探针的3 ’端均标以荧 光淬灭基团。 该引物探针组合和采用该引物探针 组合的Cycleave荧光PCR检测方法能够准确、 高 效的鉴别TS ‑11疫苗株和野毒株， 且具有高灵敏 度、 特异性、 简单易操作的优点。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 114836553 A 2022.08.02 CN 114836553 A 1.一种鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合， 其特征在于， 包括共同上游引 物、 共同下游引物、 TS ‑11疫苗株探针和野毒株探针， 所述共同上游引物的核苷 酸序列如SEQ   ID NO:1所示， 所述共同下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述TS ‑11疫苗株探针 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 所述野毒株探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 所 述TS‑11疫苗株探针和所述野毒株探针的5 ’端均标以荧光报告基团， 所述TS ‑11株探针和所 述野毒株探针的3 ’端均标以荧 光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合， 其特征在 于， 所述TS ‑11疫苗株探针的5 ’端标以荧光报告基团HEX， 所述TS ‑11疫苗株探针的3 ’端标以 荧光淬灭基团BHQ1； 所述野毒株探针的5 ’端标以荧光报告基团FAM， 所述野毒株探针的3 ’端 标以荧光淬灭基团BHQ1。 3.一种鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的方法， 其特征在于， 为采用权利 要求1或2的引 物探针组合的Cycleave荧 光PCR检测方法。 4.根据权利要求3所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的方法， 其特征在于， 其实时 荧光定量PCR反应体系的总体积为25 μL， 其中包括： 12.5 μL的Cycleave  PCR Reaction  Mix (2×Conc.)， 0.5 μL的10 μM的所述共同上游引物， 0.5 μL的10 μM的所述共同下游引物， 1 μL的5 μM的所述TS ‑11疫苗株探针， 1 μL的5 μM的所述野毒株探针， 2 μL的模板DNA， 7.5 μL的蒸馏水。 5.根据权利要求3所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的方法， 其特征在于， 所述模 板DNA中TS ‑11疫苗株基因组浓度≥2.43拷贝/μL， 或所述模板DNA中野毒株基因组浓度≥ 1.65拷贝/ μL。 6.根据权利要求3所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的方法， 其特征在于， 其实时 荧光定量PCR反应条件为： 95℃  30秒； 95℃  5秒， 55℃  10秒， 40个循环； 在循环延伸时进行 荧光信号检测。 7.根据权利要求3所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的方法， 其特征在于， 其结果 判定标准为： FAM通道， 当Ct值大于36个循环时， 判为阴性， Ct值小于等于36个循环时， 判为 阳性； VIC通道， 当Ct值大于 36个循环时， 判为阴性。 Ct值小于等于 36个循环时， 判为阳性。 8.根据权利 要求1或2所述的鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合在鸡毒支 原体检测试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836553 A 2鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合、 方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物病原检测技术领域， 尤其涉及鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的 引物探针组合、 方法及应用。 背景技术 [0002]鸡毒支原体(Mycoplasma  gallisepticum,MG)又称鸡败血霉形体， 是引起鸡的慢 性呼吸道疾病的主要病原， 也是生物制品及活疫苗生产中支原体污染的一个重要污染病 原， 易引起鸡呼吸道粘膜炎症， 使肉鸡品质下降， 对种鸡的产蛋率， 受精率及孵化率都有显 著影响。 M G感染在我国鸡群中相当普遍， 分布于全国多个省市， 每年均会造成巨大的经济损 失， 严重阻碍我国养鸡业的发展。 MG感染既可通过水平传播， 又可经蛋垂直传播， 鸡群发生 感染时很难将其彻底清除， 从而导致该病在鸡群中能够长期存在并且广泛蔓延， 使得MG感 染的预防和控制存在着很大的困难。 在MG活苗研究中， 日本、 法国、 美国分别将G250株、 CP 株、 F株、 TS ‑11株及6/85株制成疫苗应用， 其中， TS ‑11疫苗株是由Melbourne大学 KevinWhithera教授与澳大利亚生物资源公司共同研制和开发的， 具有对温度敏感、 安全性 高、 毒力稳定和保护时间长的特点。 MG  TS‑11株活疫苗临床使用效果反应较好， 在我国鸡群 中使用比较广泛。 但是， 由于缺乏疫苗免疫后毒株定植评价的有效方法， 不能系统的进行免 疫后的评价。 [0003]因此， 鉴别诊 断MG疫苗株TS ‑11株与野毒株对鸡场支原体检测与净化具有重要意 义。 目前用于M G检测的方法主要以常规P CR和血清学检测为主。 虽然 血清学方法快速简 便易 行， 但无法直接区分TS ‑11疫苗株与野生型毒株， 不易判断免疫效果。 为了鉴别TS ‑11疫苗株 和野毒株， 国内外学者做了很多研究， 如国内有曾报道过的一种MG疫苗株与野毒株区分方 法(MG疫苗株和野毒株的PCR鉴定[J]畜牧与兽医2020年第52卷第8期)， 采用通过套氏PCR增 加扩增的特异性和敏感性， 此方法虽然可以区分TS ‑11和野毒株， 但是此方法相对比较繁 琐， 不利于应用； 另一种鉴定方法(鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法 的建立 [J]动物医学进展， 2020， 41(6)： 27－31)， 采用双重PCR， 可以同时区分MG、 MS 感染， 但是， 该 方法无法区分MG  TS‑11疫苗株和野毒株； 中国专利CN  110218808  B公开了滑液囊支原 体和 鸡毒支原体的四重PCR检测试剂盒， 可以区分鸡毒支原体疫苗株F与野毒株， 但是无法进行 TS‑11疫苗株和野毒株的区分， 而且检测时长较长， 需要2个小时才能完成检测， 检测效率过 低。 发明内容 [0004]本发明针对上述技术问题， 提出鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合、 方法及应用。 该引物探针组合和方法能够准确、 高效的鉴别TS ‑11疫苗株和野毒株， 且具有 高灵敏度、 特异性、 简单易操作的优点。 [0005]为了达到上述目的， 本发明采用的技 术方案为： [0006]本发明第一方面公开了一种鉴别MG的TS ‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合， 包说　明　书 1/8 页 3 CN 114836553 A 3