(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210480050.9 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 领航基因科技 （杭州） 有限公司 地址 310000 浙江省杭州市萧 山区南阳街 道横蓬园区红山工业区 (72)发明人 夏江　高学娟　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 王欢 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 根霉菌PCR检测的引物、 探 针及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物检测技术领域， 尤其涉及根 霉菌PCR检测的引物、 探针及其试剂盒。 本发明引 物探针可实现根霉菌的七个种的快速检测， 准确 性和特异性好、 灵敏度高， 便于实时评估患者健 康状况， 及时为临床医生提供辅助治疗建议， 对 提高根霉感 染患者的存活率有着重要的意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 114908085 A 2022.08.16 CN 114908085 A 1.引物探针组合， 其特 征在于， 包括： SEQ ID NO： 1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ  ID NO： 3所示核苷酸序列的探针。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 还包括检测外源内参的引物和探 针； 所述检测外源内参的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:4～5所示； 所述检测外源内参的探针， 核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述探针的5 ’端标记荧光报 告基团， 3 ’端标记淬灭基团； 所述荧光该报告基团为FAM、 VIC、 ROX、 C Y5、 CY5.5、 CY7、 ATTO‑425或ATTO‑633； 所述猝灭基团为MGB或BHQ1。 4.根据权利要求2所述的引物探针组合， 其特 征在于， SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5 ’端标记有荧光报告基团FAM， 3 ’端标记有荧光 淬灭基团MGB； SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5 ’端标记有荧光报告基团VIC， 3 ’端标记有荧光 淬灭基团BHQ1。 5.权利要求1～4任一项所述的引物探针组合在制备根霉菌PCR检测 的试剂盒中的应 用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述根霉菌包括葡萄根霉、 少根根霉、 黑根 霉、 少孢根霉、 米根霉、 有性 根霉和根样根霉中的至少一种。 7.检测根霉菌的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1～4任一项所述的引物探针组合。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括数字PCR的检测试剂； 所述检测试 剂包括无菌水、 d dPCR Mix、 DNA扩增酶、 dNTP、 Mg2+中的至少一种。 9.根据权利要求7 所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括提取待测样本DNA的提取 试剂。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述样本包括食品样本、 血液样本、 石 蜡切片、 病理 组织、 穿刺样本中的至少一种。 11.非诊断目的的检测根霉菌的方法， 其特征在于， 利用权利要求1～4任一项所述的引 物探针组合或权利要求7～10任一项所述的试剂盒对样本进行检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908085 A 2根霉菌PCR检测的引物、 探针及其试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 尤其涉及检测根霉菌PC R检测的引物、 探针及其试 剂盒。 背景技术 [0002]根霉菌为条件致病真菌， 致病的有匍枝根霉、 小孢根霉、 少根根霉和米根霉等。 该 菌可存在于正常人的口腔和鼻咽部， 健康人吸入霉菌孢子后， 可很快被巨噬细胞清除， 当患 者免疫力低下时， 成为其感染的高危人群,多并发于糖尿病,白血病,器官移植,恶性肿瘤， 粒细胞缺乏症,大手术后的患者， 严重营养不良,酸中毒及免疫抑制药物,化疗,激素和广谱 抗生素的大量使用也可诱 发。 在日常生活中， 它也常会引起食品霉变， 主要引起淀粉质食品 如馒头、 面包等发霉 变质， 也能引起蔬菜霉烂 。 [0003]根霉感染属于弥散性感染， 发展特别快， 死亡率特别高。 目前检测方法的滞后性 (主要镜检)， 主要停留在尸检中， 无法及时、 有效地对感染期患者进 行检测， 因此， 急需提供 一种能够快速、 有效的检测根霉菌的方法， 便于实时评估患者健康状况， 及时为临床医生提 供辅助治疗建议， 对提高根霉感染患者的存活率有着重要的意 义。 [0004]数字PCR技术是在qPC R技术上发展起来的第三代PC R技术， 理论上可以实现对单个 拷贝的目标核酸片段进 行扩增检测， 是当前灵敏度最高的核酸检测技术。 然而， 目前尚未见 将数字PCR应用于根霉菌检测的报道。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了根霉菌PCR检测的引物、 探针及其试剂盒， 该引物探针组 合结合数字PCR技术， 可快速实现 的根霉菌中葡萄根霉、 少根根霉、 黑根霉、 少孢根霉、 米根 霉、 有性根霉和根样根霉七个种的联合检测， 准确性 好、 灵敏度高， 且检测时间短。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0007]引物探针组合， 其特 征在于， 包括： [0008]SEQ ID NO： 1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ  ID NO： 3所示核苷酸序列的探针。 [0009]本发明中， SEQ  ID NO： 1～2所示的引物和SEQ  ID NO： 3所示的探针， 针对根霉菌的 葡萄根霉、 少根根霉、 黑根霉、 少孢根霉、 米根霉、 有性根霉和根样根霉七个种的保守区域设 计， 保守区域的长度为154bp， 具体序列为 为： [0010]TAACAATGCAGGGCCTTTATCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCG GTAATTCCA GCTCCAATA GCGTATATTAAA GTTGTTGCA GTTAAAACGTCCGTA GTCAAACTTTA GTCTTAAAACT TAAAGGAATT。 [0011]本发明提供的引物探针组合还 包括检测外源内参的引物和探针； [0012]所述检测外源内参的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:4～5所示； [0013]所述检测外源内参的探针， 核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 [0014]其中， SEQ ID NO： 4～5所示的引物和SEQ  ID NO： 6所示的探针外源内参IC ‑S设计，说　明　书 1/7 页 3 CN 114908085 A 3