(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210484131.6 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 南京林业大 学 地址 210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 (72)发明人 王嘉陈　许唯　刘宏毅　卢轶凡　 (74)专利代理 机构 南京智转慧移知识产权代理 有限公司 32649 专利代理师 田沛沛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种检测霓虹脂 鲤属下物种存在的环境DNA 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测霓虹脂鲤属下物种 存在的环境DNA的方法， 属于生物技术检测领域。 包括以下步骤： 1)待测样品环境DNA的提取； 2)以 待测样品环境DNA为模板， 采用霓虹脂鲤属下物 种特异性引物对进行PCR扩增； 3)根据电泳结果 是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否存 在霓虹脂鲤属下物种。 本发明利用霓虹脂鲤属下 物种残留水体中的粪便、 皮肤脱落物及尸体等遗 迹提取环境DNA样品， 结合 分子生物学技术， 开发 出具有特异性且扩增效率高的PCR引物， 建立了 可针对霓虹脂鲤属下物种的快速， 准确的检测鉴 定方法。 为监测可能发生的外来物种入侵提供了 新的技术手段， 对于防止霓虹脂鲤属下物种的入 侵具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114752689 A 2022.07.15 CN 114752689 A 1.一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境DNA的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)待测样品环境DNA的提取； 2)以待测样品环境DNA为模板， 采用霓虹脂鲤属下物种特异性引物对进行PCR扩增； 3)根据电泳结果是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否存在霓虹脂鲤属下物种； 所述霓虹脂鲤属下物种特异性引物对如下： 上游引物： 5 ′ ‑CTACAGCCCAACTTATACAT‑3′； 下游引物： 5 ′ ‑TTCTTGTATTATTAACATCT‑3′。 2.根据权利要求1所述的检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境DNA 的方法， 其特征在于， 若电泳结果中出现450 ‑500bp的条带， 则表明待测样 品来源的环境中存在霓虹脂鲤属下物 种； 若电泳结果未发生特异性的扩增， 则待测样品来源的环境中不存在霓虹脂鲤属下物种。 3.根据权利要求1所述的检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境DNA 的方法， 其特征在于， PCR反应体系为： 每26 μL体系中， 含有Taq酶12.5 μL， 上下游引物各1μL， DNA模板1μL和ddH2O  10.5 μL。 4.根据权利要求1所述的检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境DNA 的方法， 其特征在于， PCR扩增程序为： 94℃ 预变性5min； 94℃变性30s， 50℃退火30s， 72℃延伸30s， 35个循环； 72 ℃延伸5mi n。 5.用于环境DNA检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对， 其特征在于， 所述特异性 引物对如下： 上游引物： 5 ′ ‑CTACAGCCCAACTTATACAT‑3′； 下游引物： 5 ′ ‑TTCTTGTATTATTAACATCT‑3′。 6.含有权利要求5所述的用于环境DNA检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对的 检测试剂或检测试剂盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752689 A 2一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境 DNA的方法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术检测领域， 具体涉及 一种检测霓虹脂鲤属下物种存在的环境 DNA的方法。 背景技术 [0002]霓虹脂鲤属Paracheirodon， 是鲤形目Cypriniformes， 脂鲤亚目Characoidei， 脂 鲤科Characidae下的一属， 本属下仅有三种， 分别是霓虹脂鲤Paracheirodon  innesi、 阿氏 霓虹脂鲤Parach eirodon axelrodi和类霓虹脂鲤Parach eirodon simulans。 原分布 于南美 洲， 由于躯体细小、 色彩华丽、 性情温顺、 容易饲养、 好集群游动， 深受世界各地观赏鱼市场 的青睐。 上个 世纪中后期被引入国内， 现在 在全国范围内是高度商业 化的重要的观赏鱼类。 [0003]霓虹脂鲤属下鱼类可以在观赏鱼市场上随意买卖， 数量也极多。 故难免会存在逃 逸或者被人为放生， 进入野生环境的情况。 虽然普遍认为， 在中国的野生环境中， 该属下各 种生存， 繁殖较困难。 但考虑到很多南美鱼类如多辐翼甲鲶Pterygoplichthys   multiradiatus、 图丽鱼Astronotus  ocellatus、 短盖肥脂鲤Pi aractus brachypomus都在 我国华南地区有过发现。 故在我国的华南地区很有可能存在适宜该属下物种生存的水生环 境。 虽然暂时并没有关于 霓虹脂鲤属下的鱼类入侵我国的报道， 但在东南亚的一些国家， 已 经存在一些 该属鱼类的野生种群。 [0004]在往常的实践中， 传统的水生生物入侵监测方法， 如拖网、 围网、 电捕鱼、 钓鱼和目 视等方法， 具有高成本、 低捕获率、 耗时长、 难实施、 可能会破坏调 查点的生态系统等缺点。 不能大面积实施， 也不够敏感。 若使用传统的生物入侵监测方法， 往往要到暴 发阶段后才能 发现入侵物种种群。 此时再进 行治理， 往往效果较差。 只有在物种入侵的初期就能确定其分 布， 才能尽早治理， 有效治理。 故建立快速、 高效、 敏感的生物入侵监测方法是刻不 容缓的。 [0005]动物在某个环境中生活， 身上的各种痕迹会携带着自身D NA掉落到四周。 这些在环 境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合被称为环 境DNA(eDNA， environmental   DNA)。 环境DNA环境样品是一个非常宽松的概念， 可以包括土壤、 沉积物、 排泄物、 空气、 水 体， 甚至生物个体本身。 环境DNA分析是最近开发的一种灵敏、 高效且对生物无损伤的调 查 工具。 目的就是获取这些环境样品中DNA所属物种的分类学信息和基因功能信息， 从而明确 在相应环境中物种的存在。 该技术不需要与被测物种直接接触， 即使在被测物种密度极低 时也可测出。 使用这项技术， 即可代替灵敏度低， 成本高， 难以大规模实施的传统监测方法， 解决不能及时发现入侵物种的难题。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的上述问题， 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测霓虹 脂鲤属下物种存在的环境DNA的方法； 本发明所要解决的另一技术问题是提供一种用于环 境DNA检测霓虹脂鲤属下物种存在的特异性引物对。 [0007]为了解决上述 技术问题， 本发明所采用的技 术方案如下：说　明　书 1/5 页 3 CN 114752689 A 3